王秦 张家佳 刘成桂

摘要：目的  建立高表達IL-12的卵巢癌细胞，为后续IL-12治疗卵巢癌奠定基础。方法  将人卵巢癌细胞株SKOV3分为SKOV3组、SKOV3/GFP组和SKOV3/IL-12组三个实验组，SKOV3组不做任何处理，SKOV3/GFP组给予空载病毒感染SKOV3细胞，SKOV3/IL-12组给予IL-12基因腺病毒感染SKOV3细胞。腺病毒感染SKOV3细胞48 h后，使用荧光显微镜检测三个实验组的感染效率，RT-PCR检测各组SKOV3细胞IL-12 p35、p40 mRNA水平的表达量，ELISA方法检测感染72 h后各组细胞培养液中IL-12的含量。结果  SKOV3/GFP和SKOV3/IL-12组中的SKOV3细胞均可以在荧光显微镜下观察到绿色荧光，而SKOV3组没有观察到绿色荧光，SKOV3/GFP和SKOV3/IL-12组的感染效率分别是（97±1）%和（95±1）%，差异具有统计学意义（P<0.05）;RT-PCR结果表明，与SKOV3和SKOV3/GFP组相比较，SKOV3/IL-12组可以成功扩增出IL-12 p35、p40亚基，差异具有统计学意义（P<0.05）;ELISA结果表明，与SKOV3和SKOV3/GFP组比较，SKOV3/IL-12组能够高表达IL-12P70蛋白，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论  成功建立了高表达IL-12的卵巢癌SKOV3细胞，为进一步采用IL-12进行卵巢癌的免疫治疗打下了基础。

关键词：IL-12;卵巢癌;高表达;SKOV3细胞

中图分类号：R737.3                                   文献标识码：A                               DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.21.024

文章编号：1006-1959（2019）21-0078-04

Abstract：Objective  To establish ovarian cancer cells with high expression of IL-12， and lay a foundation for the subsequent treatment of ovarian cancer with IL-12. Methods  The human ovarian cancer cell line SKOV3 was divided into three groups： SKOV3 group， SKOV3/GFP group and SKOV3/IL-12 group. SKOV3 group was not treated. SKOV3/GFP group was given virus-infected SKOV3 cells，The SKOV3/IL-12 group was administered with IL-12 gene adenovirus to infect SKOV3 cells. After infection with SKOV3 cells for 48 h， the infection efficiency of the three experimental groups was detected by fluorescence microscopy. The expression levels of IL-12 p35 and p40 mRNA in SKOV3 cells were detected by RT-PCR. ELISA method was used to detect the content of IL-12 in the culture medium of each group 72 h after infection.Results  The SKOV3 cells in the SKOV3/GFP and SKOV3/IL-12 groups were observed to have green fluorescence under the fluorescence microscope， while the green fluorescence was not observed in the SKOV3 group， and the infection efficiencies in the SKOV3/GFP and SKOV3/IL-12 groups were （ 97±1）% and （95±1）%， the difference was statistically significant （P<0.05）;RT-PCR results showed that compared with SKOV3 and SKOV3/GFP group， ILOV p35 and p40 subunits could be successfully amplified in SKOV3/IL-12 group， the difference was statistically significant （P<0.05）; ELISA results showed Compared with SKOV3 and SKOV3/GFP group， SKOV3/IL-12 group can express IL-12P70 protein with high expression，the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion  The ovarian cancer SKOV3 cells with high expression of IL-12 have been successfully established， which lays a foundation for further immunotherapy of ovarian cancer with IL-12.

Key words：IL-12;Ovarian cancer;High expression;SKOV3 cells

卵巢癌（ovarian carcinoma）是一种常见的女性生殖系统恶性肿瘤，也是全球范围内最常见的妇科肿瘤之一，它是第5位致死性女性恶性肿瘤[1]，美国每年大约有14000人因卵巢癌死亡，并且有近22000名妇女被新确诊为卵巢癌[2]。由于其处于腹部深处早期不易发现，而且肿瘤细胞容易脱落通過腹腔液向其他盆腔和腹膜器官扩散转移，所以卵巢癌的治疗效果不佳，5年总生存率约为46.5%[3]。卵巢癌的主要治疗手段是手术以及紫杉醇和铂类药物等的联合化疗，虽然大部分患者在早期进行积极的一线治疗后可以得到完全的临床缓解，但是随着化疗药物耐药性的增加，越来越多的患者在复发后将难以治愈，也缺乏更有效的治疗手段，近年来国内外研究者一直致力于靶向药物免疫疗法来治疗肿瘤，这一疗法为复发性卵巢癌的治疗带来了新的曙光[4]。白细胞介素12（IL-12）是人体内重要的细胞因子，它主要由抗原递呈细胞分泌并参与免疫调节过程，具有抗肿瘤抗炎的作用，也广泛应用于多种肿瘤的治疗之中[5]，本实验拟建立高表达IL-12的卵巢癌细胞株模型，观察IL-12在卵巢癌细胞株中是否能高表达，为后续IL-12治疗卵巢癌奠定基础。

1材料与方法

1.1材料  实验室前期构建保存的携绿色荧光蛋白的空载病毒载体pAd5F35-GFP和重组人IL-12腺病毒载体pAd5F35-IL-12[6]，实验室前期保存的人卵巢癌细胞株SKOV3，胎牛血清和细胞培养液RPMI-1640购自Gibco公司，磷酸盐缓冲液PBS购自博士德公司，总RNA提取试剂Trizol、逆转录试剂盒以及DNA Maker均购自TaKaRa公司，大连宝生物技术公司合成实验所需引物（IL-12 p35、p40和β-actin），ELISA试剂盒（检测人IL-12 p70蛋白）购自R&D公司。

1.2方法

1.2.1培养卵巢癌细胞SKOV3  在生物安全柜中复苏冻存的人卵巢癌细胞株SKOV3，用已配好的细胞培养液（含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液）培养，全程无菌操作，然后将细胞放置于37℃含5% CO2的孵箱中进行培养。24 h后观察SKOV3细胞生长的情况并更换培养液，此后细胞每天换液，隔天传代1次，然后选用对数生长期的SKOV3细胞进行后续的实验。将人卵巢癌细胞株SKOV3分为SKOV3组、SKOV3/GFP组和SKOV3/IL-12组三个实验组，SKOV3组不做任何处理，SKOV3/GFP组给予空载病毒感染SKOV3细胞，SKOV3/IL-12组给予IL-12基因腺病毒感染SKOV3细胞。

1.2.2重组人IL-12腺病毒感染卵巢癌细胞株SKOV3  离心收集前期培养的对数生长期的SKOV3细胞，细胞培养液重悬细胞后计数，然后三组中分别加入1×106个卵巢癌细胞，其中SKOV3组不做处理，SKOV3/GFP和SKOV3/IL-12组分别加入相应感染复数为100并带有绿色荧光蛋白的腺病毒，处理48 h后使用显微镜观察SKOV3细胞的形态和荧光表达情况，并采集三个实验组的细胞图片。

1.2.3 RT-PCR测定各组SKOV3细胞IL-12 p35、p40 mRNA水平的表达量  按照1.2.2的操作收集病毒感染48 h后的三组SKOV3细胞，先使用总RNA提取试剂Trizol提取SKOV3细胞的总RNA，然后将RNA逆转录为cDNA，以此为反应模板在PCR仪上进行聚合酶链反应，扩增内参基因β-actin、IL-12 p35、p40基因，扩增基因时先在GeneBank中查找β-actin、IL-12 p35、p40的基因序列，分别是NM_001101.3，NM_000882.3和NM_002187.2，然后根据基因序列设计合成相应的引物，见表1。扩增反应完成后立即将产物收集起来进行琼脂糖凝胶电泳，采用的是浓度为2.5%的凝胶进行电泳，电泳条件是180 V电泳15 min，电泳完成后在凝胶成像仪下观察三组基因的扩增情况并拍照，采用Quantity One软件对电泳的条带进行分析。

1.2.4 ELISA方法检测卵巢癌细胞培养液中IL-12的含量  按照1.2.2的操作收集病毒感染72 h后的三组SKOV3细胞培养液，10000 r/min离心5 min后使用无菌吸管吸取上清液，低温保存备检，然后根据IL-12 ELISA试剂盒操作说明书进行细胞培养液中IL-12 p70蛋白的检测，最终通过绘制标准曲线的方法计算出三个实验组培养液中IL-12 p70蛋白的具体含量。

1.3统计学分析  使用SPSS 17.0软件对数据进行分析，实验数据均使用（x±s）表示，行单因素方差分析，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2结果

2.1 IL-12腺病毒感染SKOV3细胞的感染效率  荧光显微镜下观察到SKOV3/GFP组和SKOV3/IL-12组中的SKOV3细胞均可以发出绿色荧光，而SKOV3组不能发出绿色荧光;SKOV3组，SKOV3/GFP组和SKOV3/IL-12组的感染效率分别是0%、（97±1）%、（95±1）%，差异具有统计学意义（P<0.05），见图1。

2.2逆转录PCR检测IL-12 p35、p40 mRNA水平  重组IL-12腺病毒感染SKOV3细胞48 h后逆转录PCR检测到：与SKOV3组和SKOV3/GFP组相比较，SKOV3/IL-12组可以观察到扩增出的155 bp的IL-12 p35条带和148bp的IL-12 p40条带，而其他两组均未检测到相应亚基的条带，差异具有统计学意义（P<0.05），见图2。这表明IL-12腺病毒可以 成功感染SKOV3细胞并在mRNA水平表达IL-12基因。