王德立，齐耀东

1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 海南分所，海南 海口 570311；2.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193

蛇足石杉Huperziaserrata(Thunb.ex Murray)Trevs，又名千层塔，隶属石杉科石杉属，为一种拟蕨类植物，多年生草本，高20～30 cm，生长于潮湿、富含腐殖质的林下。在我国主要分布在长江以南各省，尤以江西、安徽、湖南、重庆等地较多。该植物为我国一种传统中药材，以茎叶入药，常用于治疗瘀血肿痛、挫伤等[1]。现代研究表明，蛇足石杉植物体含石杉碱甲，对治疗早老性痴呆效果较好，且毒副作用最小[2]。该物种也因此引起全世界人们的关注，对其原料需求量剧增。但该植物生长较为缓慢，年生长高度2～3 cm[3]，大量无序采集造成资源储量迅速减少，野生资源分布范围迅速萎缩，加上环境不断变化，尤其是干旱气候影响，导致部分地区的蛇足石杉储量锐减甚至绝迹。

当前蛇足石杉资源储量远不能满足市场需求，要解决原料短缺问题最为有效的措施是开展规模化种植，而目前迅速扩繁技术尚未成熟，致使规模化生产难以实施。蛇足石杉的主要繁殖方式为孢子繁殖和芽胞繁殖[4]。尽管由芽胞萌发生长至成熟孢子体的周期较短，但芽胞数量较少，不足以实施产业化。孢子繁殖是实施产业化的潜在方式，成株可每年产生几个至几十个孢子囊，每个孢子囊内含上万个孢子。但在人工可控环境中如何促进大量孢子快速萌发是当前亟待解决的难题。在野外，成熟的孢子散落在富含腐殖质、潮湿的土壤中，于适宜条件下萌发，经过配子体世代形成孢子体。而在人工控制条件下孢子却难以萌发，调查发现孢子休眠时间较长，几年甚至十几年，但休眠原因及打破休眠的方法尚不清楚。野生环境中可能存在促进孢子萌发的微生物和多种酶类。土壤中的酶类主要有：过氧化氢酶、多酚氧化酶、腺酶、蛋白酶、磷酸酶、脱氢酶和蔗糖酶等[5-6]，这些酶是土壤生化过程中重要参与者，在物质和能量交换过程中起重要作用[7]。

蛇足石杉适宜生长在多年生林地土壤中，土壤含有丰富的酶类，这些酶可能对蛇足石杉的孢子萌发和植株生长起到直接或间接的促进作用。蛇足石杉内生菌以及微生物促进孢子萌发已有研究[8-9]，目前尚未找到能够促进孢子萌发的关键微生物，也未见关于土壤酶对蛇足石杉孢子萌发影响的报道。本研究拟通过分析以孢子繁殖为代表的重庆市黄水镇蛇足石杉天然居群及以芽胞繁殖为代表的海南昌江霸王岭自然保护区蛇足石杉天然居群的土壤酶活性差异，找出可能促进孢子萌发和植物生长的土壤酶。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 采样位置 土壤材料采集地点为重庆石柱县黄水镇，海拔1300 m左右，地理坐标：N27°29′，E108°39′；海南省霸王岭自然保护区石峰，海拔1300 m左右，地理坐标：N18°50′，E109°05′。

1.1.2 样地类型及采样方法

1.1.2.1 重庆黄水镇样地(CQ) 该样地蛇足石杉居群主要分布在生长10年以上的柳杉林下，居群大小视柳杉林地面积而定。分别采集生长5年、10年和15年的柳杉林内地表20 cm的土壤，其中10年和15年柳杉林地有蛇足石杉分布，10年林地内仅有幼苗和幼株，15年林地既有成株又有幼苗和幼株。每个居群采集6份土样，每份土样按X取样法采集5份土样混合而成。

1.1.2.2 海南霸王岭样地(HN) 该样地包括东五样地和东二样地，其中东五样地海拔1300 m左右，有蛇足石杉分布，居群面积约1200，该居群繁殖方式以芽胞繁殖为主，80%的幼苗来自芽胞，95%以上的成株均产生芽胞；东二样地无蛇足石杉部分，海拔800 m左右。两样地均采用S取样法在该居群中采集距地表20 cm左右的土壤。每个样地、每种林地类型分别采集土样6份。

1.2 测定方法

采用酶联免疫法测定蛋白酶(活性单位为U·L-1)、过氧化氢酶(活性单位为IU·L-1)、多酚氧化酶(活性单位IU·L-1)、脲酶(活性单位IU·L-1)、蔗糖酶(活性单位U·L-1)、磷酸酶(活性单位为U·L-1)、纤维素酶(活性单位U·L-1)。

经测定标准溶液，得出7种酶活性的标准曲线方程：蛋白酶：Y=25.113 4X+0.178 3(r=0.998 4)；过氧化氢酶：Y=69.787X+3.454 9(r=0.998 3)；多酚氧化酶：Y=207.234 7X+8.858 2(r=0.998 3)；脲酶：Y=503.927 9X+8.234 5(r=0.998 3)；蔗糖酶：Y=425.528 8X+15.066 0(r=0.998 7)；磷酸酶：Y=413.770 9X+1.375 8(r=0.998 5)；纤维素酶：Y=82.528 5X+2.24(r=0.998 7)。

1.3 数据处理

数据用SPSS17.0进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 两个蛇足石杉居群的土壤酶活性比较

土壤酶活性比较见表1。蛋白酶活性、过氧化氢酶活性和多酚氧化酶活性：重庆15年林地>海南东五样地；脲酶活性和蔗糖酶活性：重庆15年林地<海南东五样地；纤维素酶活性、磷酸酶活性：两样地无显著性差异。

表1 两个蛇足石杉居群土壤酶活性比较

注：不同字母表示差异有统计学意义(P<0.05)；下同。

2.2 重庆不同株龄林地土壤酶活性比较

重庆黄水镇不同株龄的柳杉林中土壤酶活性比较见表2。15年株龄的柳杉林地蛋白酶活性、过氧化氢酶活性及磷酸酶活性较高；5年和10年株龄柳杉林地多酚氧化酶、脲酶、蔗糖酶活性较高；5年株龄林地活性较低的土壤酶有蛋白酶、过氧化氢酶、磷酸酶。

2.3 海南霸王岭两样地土壤酶活性比较

海南霸王岭样东五样地和东二样地土壤酶活性结果见表3。东二样地蛋白酶活性、蔗糖酶活性、纤维素酶活性及磷酸酶活性均高于东五样地，而过氧化氢酶、多酚氧化酶、脲酶等酶活性无显著差异。

3 讨论

土壤酶包括胞内酶和胞外酶，主要来源于土壤微生物、植物根系分泌物和动植物残体，是生态系统的物质循环和能量流动等生态过程中最为活跃的生物活性物质[7，10-11]。土壤酶种类和活性反映了土壤肥力状况，影响根系对养分、水分的吸收，从而影响植物生长发育[12]。目前尚未实现蛇足石杉规模化种植，仅有小面积栽培，且种苗全部来自于野生，因此原生境对孢子萌发极其重要，原生境中的土壤酶可能对孢子萌发有促进作用，也会影响蛇足石杉生长发育。

表2 重庆黄水镇不同株龄柳杉林地土壤酶活性

注：不同字母表示差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 海南霸王岭东五样地和东二样地土壤酶活性

重庆黄水镇15年柳杉林样地和海南霸王岭样地均有蛇足石杉成株和大量幼苗，前者以孢子幼苗为主，后者以芽胞幼苗[4](芽胞为蛇足石杉无性繁殖体，从母株脱落后直接萌发成幼苗)为主。这表明重庆15年林地环境更适宜孢子繁育与植株生长。从两个样地的土壤酶活性来看(表1)，蛋白酶活性、过氧化氢酶活性和多酚氧化酶活性：重庆15年林地样地>海南东五样地，这表明这3种酶可能更有利于孢子萌发和植株生长。其中蛋白酶可促进孢子壁的溶解和相关蛋白质的转化，以打破孢子休眠，促进孢子萌发；过氧化氢酶可有效保护孢子内原生质体中的多种物质，避免被氧化而失去活性；多酚氧化酶活性可有效避免在孢子萌发过程中受到病菌或其他有害物质的侵害，因此较高的多酚氧化酶活性更有利于孢子萌发。而海南东五样地由于土壤蛋白酶、过氧化氢酶和多酚氧化酶活性偏低，可能缺少孢子萌发的必要条件，因此孢子幼苗极少，而芽胞幼苗较多。脲酶、蔗糖酶、磷酸酶均分解土壤中的营养物质，其活力大小均反应了土壤肥力水平，这些酶活力高低直接影响植物长势。这3种酶活性：海南东五显著高于重庆15年林地样地，这也进一步验证了海南蛇足石杉生长速率高于重庆样地的现象[3]。两样地的纤维素酶活性差异不显著，这可能与两样地均为多年生次生林，地表均积累了丰富的枯枝、落叶有关。

由表2知重庆样地不同生长年限的柳杉林土壤酶活性差异明显。蛋白酶活性：15年>10年>5年，这说明随着乔木生长年限增加，蛋白酶活性不断增强，而5年林地没有蛇足石杉分布，10年林地偶尔有分布，15年林地有大量分布，由此推测蛋白酶可能影响蛇足石杉孢子萌发。过氧化氢酶活性：15年=10年>5年，即10年之后林地土壤过氧化氢酶活性变化不大，该酶也可能对孢子萌发起促进作用。多酚氧化酶在不同年限林地间无规律的变化趋势，而脲酶、蔗糖酶的纤维素酶的活性5年株龄林地最高，15年株龄林地较低，这说明林地早期阶段为待分解的营养较多，也是物质快速转化阶段。磷酸酶活性随着林地年限的增加呈增强趋势，这表明土壤中可被直接吸收的磷元素减少，磷酸酶活性增加可将土壤中难溶性磷转化为可溶性磷，为植物提供可直接吸收的磷元素。

海南蛇足石杉居群的主要繁殖方式为芽胞繁殖，该繁殖方式与孢子繁殖不同，不需要经过孢子萌发形成配子体即没有配子体世代。该样地有蛇足石杉分布的居群土壤蛋白酶、蔗糖酶、纤维素酶和磷酸酶均低于无蛇足石杉分布的居群，过氧化氢酶、多酚氧化酶及脲酶差异无统计学意义(表3)。这种差异可能源自环境温度不同，有蛇足石杉的样地海拔1300 m左右，而无蛇足石杉的样地海拔800 m左右。由此可以看出温度对蛇足石杉的芽胞萌发和植株生长影响较大，虽然养分条件较好，但较高的温度也不适宜蛇足石杉生长，这与蛇足石杉喜温凉、耐严寒、怕高温的生物学特性有关。

由此推测，蛇足石杉孢子萌发及植株生长可能与多种土壤酶活性息息相关。蛋白酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶可能对孢子萌发有重要影响，脲酶、蔗糖酶、纤维素酶和磷酸酶可能和植株生长有关。因此在孢子培养过程中可适当加入相应的酶以促进孢子萌发和幼苗生长。