张坚，李先宽，李兴林，马琳，陈志娟

1.天津中医药大学 中药学院，天津 301617；2.天津科技大学 生物工程学院/工业微生物教育部重点实验室，天津 300457

桔梗Platycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.为桔梗科桔梗属多年生草本植物，根为传统中药桔梗，具有祛痰功效。此外，桔梗还是一种集药食两用和观赏于一身的植物，因此桔梗综合应用价值很高。随着桔梗在我国需求量的不断增加，野生桔梗资源远远不能满足需求[1]，所以近年来很多研究者对桔梗人工栽培技术进行了研究[2]。一氧化氮(nitric oxide，NO)是一种普遍存在于生物体内的具有生物活性和信号传导作用的易扩散分子，对植物许多生命活动具有调节作用，很多研究表明NO对植物生长有促进作用，且对逆境胁迫下植物的生长具有改善作用[3-5]。目前有关外源性NO的促进桔梗生长和诱导桔梗体内皂苷积累的研究还鲜有涉及，故本研究考察了外源性硝普钠(sodium nitroprusside，SNP)对桔梗幼苗的生长和对幼苗中总皂苷诱导的影响，并对桔梗幼苗中脯氨酸(proline，Pro)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶(peroxidase，POD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)等生理活性指标进行测定，初步分析这一过程的生理机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 当年成熟桔梗Platycodongrandiflorus(Jacq.)A.DC.种子，购于河北安国市场，经天津中医药大学马琳教授鉴定为中药桔梗种子，通风干燥处保存备用。

1.1.2 主要试剂及药品 桔梗皂苷D(上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：58479-68-8)，硝普钠(天津市化学试剂批发公司，分析纯)，乙醇(天津市北方天医化学试剂厂，分析纯)，甲醇(天津市福晨化学试剂厂，分析纯)，浓硫酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯)，蒸馏水(自制)。

1.1.3 主要仪器 XMTB数显调节恒温水浴锅(北京长风仪器仪表公司)，752型可见-紫外分析仪(上海第三分析仪器厂)，XCA-80001电热鼓风干燥箱(天津市华北实验仪器有限公司)，FA1004电子天平(天津市天马仪器厂)，TDL-40B低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，DDL-5低速冷冻离心机(杭州艾普仪器设备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 幼苗生长试验 取成熟饱满、大小一致的桔梗种子，用蒸馏水浸泡24 h，备用。用7个相同规格的穴盆(长54 cm，宽27 cm，高6 cm)，在每个穴里装入等量的基质[珍珠岩-蛭石-营养土(1∶1∶4)]，将桔梗种子播种在穴盆中，每格种5～8株。出苗后间苗，每盆留生长一致、分布均匀的幼苗。待幼苗长出4片真叶时进行SNP诱导。分别用浓度为0.03、0.05、0.07、0.10、0.50、1.00 mmol·L-1的SNP溶液进行诱导处理，每个处理设3个重复，蒸馏水组作为空白对照组(CK)。SNP溶液在处理时采用全株喷洒的方法，每次处理用量约100 mL，以浇透为止，处理时间为傍晚，1 d处理1次，共喷洒7 d。SNP处理7 d后测量植株长度，并测量生理指标。

1.2.2 总皂苷含量 采用香草醛-硫酸显色比色法测定桔梗总皂苷含量[6]。具体方法：精确称取3.8 mg桔梗皂苷D置10 mL容量瓶中，甲醇定容得对照品溶液。称取对照品溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL置10 mL具塞试管中，水浴干燥后加入10%香草醛试液0.5 mL，60%硫酸4.5 mL，摇匀，于60 ℃水浴加热15 min，冰水浴中冷却3 min，以不加皂苷的样品为空白对照，检测波长470 nm，得回归方程Y=241.58X-0.056 3(r=0.997 0)。然后，取桔梗幼苗(含胚轴的根部)干燥粗粉约1 g(精密质量)，置索氏提取器中乙醚回流除杂后甲醇超声提取2次，每次30 min，合并滤液后浓缩，然后进行香草醛-硫酸显色反应，470 nm波长测定样品皂苷含量。

1.2.3 生理指标测定 脯氨酸含量的测定采用酸性茚三酮显色法，得回归方程Y=0.021 6X-0.016 7(r=0.997 8)。脂质过氧化产物MDA含量(μmol·g-1)的测定采用硫代巴比妥酸法。保护酶活性的测定：用氮蓝四唑(NBT)显色法在A560 nm测定SOD活性,以将NBT的还原抑制到对照一半(50%)时所需的酶量为1个酶活单位(U·g-1)；用愈创木酚法测定POD的活性[7]，以每分钟A470 nm增加0.01为1个酶活力单位(U·g-1·min-1)；CAT的活性测定采用紫外吸收法，以每分钟内A240 nm下降0.1为1个酶活力单位(U·g-1·min-1)。每个处理平行3次，取平均值。

1.2.4 数据处理 采用SPSS 17.0统计软件对数据进行方差分析，以Duncan’s新复级差法比较不同处理间的差异性，用Excel软件进行制图，Word文档进行制表。

2 结果

2.1 不同浓度SNP对桔梗幼苗生长性状的影响

NO是一种无色透明、结构简单、兼具脂溶性和水溶性的小分子生物自由基，可自由通过生物膜在植物体内发挥作用[8]。NO被认为是在植物体中普遍存在的关键信号分子[9]，适度的NO能够促进植物的生长和发育[10]。本实验中，SNP(NO供体)喷洒处理后，在短期内(2 d之内)不会出现可见性诱导现象；处理第3天后出现明显的诱导差异，首先表现在植株高度上。较低浓度的SNP有助于桔梗幼苗的生长，幼苗茎高和根长都较对照组(CK)明显增长；随着诱导时间增加，高浓度SNP(1.00 mmol·L-1)处理的桔梗幼苗出现胁迫伤害，外围叶片已有部分枯萎，叶片出现黄化畸形现象；而低浓度SNP诱导下的新生小叶长势良好，没有明显诱导伤害现象。表1为SNP处理7 d后幼苗的生长情况。从表1中可见较低浓度SNP(≤0.50 mmol·L-1)可显著促进桔梗幼苗生长，尤其当SNP浓度为0.10 mmol·L-1时，促生长作用最为明显，其苗长和根长为对照组(CK)两倍以上。

表1 不同浓度的SNP对桔梗幼苗生长性状的影响(7 d)

2.2 不同浓度SNP对桔梗幼苗生理指标的影响

2.2.1 不同浓度SNP诱导下Pro的含量 Pro是植物体内重要的渗透调节物质，同时也是植物众多可溶性物质中最常见和有效的[11]。除参与渗透调节外，Pro还发挥分子伴侣的作用，可以与细胞中生物大分子结合以稳定蛋白分子构象，同时还可以缓冲胞质的pH，维持细胞的氧化还原状态[12]。图1所示，不同浓度SNP诱导下幼苗中Pro含量随浓度增加呈现先增加后降低的趋势。当SNP浓度为0.50 mmol·L-1时，幼苗中Pro的含量最高，比对照组(CK)增加了3.99倍；当SNP浓度为1.00 mmol·L-1时，游离Pro的含量则开始降低。

注：不同小写字母表示各处理样品中Pro含量差异具有统计学意义(P<0.05)。图1 不同浓度SNP对桔梗幼苗中Pro含量的影响(n=3)

2.2.2 不同浓度SNP诱导下MDA含量 MDA植物细胞膜质过氧化的最终产物，其含量多少可以反映植物受到逆境伤害的程度[11]。图2所示，在低浓度SNP诱导下，随诱导浓度增加，幼苗中MDA含量逐渐降低；当SNP浓度增加到0.10 mmol·L-1时，MDA含量降至最低，为对照组(CK)的23%；随着SNP浓度继续增加，MDA含量则开始增加；当SNP浓度增加到1.00 mmol·L-1时，MDA含量增加至空白对照组的1.54倍。

注：不同小写字母表示各处理样品中MDA含量差异具有统计学意义(P<0.05)。图2 不同浓度的SNP对桔梗幼苗中MDA含量的影响(n=3)

2.2.3 不同浓度SNP诱导下抗氧化酶活性 SOD、POD、CAT为植物体内重要的保护酶，维持植物细胞内活性氧的代谢平衡。当植物受到逆境胁迫时，活性氧等有害物质会大量产生并不断积累，从而导致细胞膜脂质过氧化，造成细胞通透性增强，细胞内含物的渗出。植物自身的保护酶系统通过调节酶活性而增强细胞内活性氧清除能力，减少由于活性氧而对细胞造成的损伤，保护细胞膜的正常功能[13-14]。

2.2.3.1 SOD活性 如图3所示，SNP对SOD活性的影响表现为低浓度促进，高浓度抑制。随着SNP溶液浓度的增加，SOD活性不断增加。当SNP溶液浓度增加至0.10 mmol·L-1时，SOD的活性最大，为对照组(CK)的4.34倍，当SNP浓度继续增加，则SOD活性迅速降低。

2.2.3.2 POD活性 如图4所示，SNP对幼苗中POD活性的影响表现趋势同SOD。随着SNP浓度的增加，POD活性不断增加，当SNP溶液浓度增加至0.10 mmol·L-1时，幼苗中POD的活性增加至空白对照组(CK)的5.05倍；继续增加SNP浓度，POD活性迅速下降。

注：不同小写字母表示各处理样品中SOD活性差异具有统计学意义(P<0.05)。图3 不同浓度的SNP对桔梗幼苗中SOD活性的影响(n=3)

注：不同小写字母表示各处理样品中POD活性差异具有统计学意义(P<0.05)。图4 不同浓度的SNP对桔梗幼苗中POD活性的影响(n=3)

2.2.3.3 CAT活性 图5所示，SNP对CAT活性的影响也表现为低浓度促进、高浓度抑制的规律。当SNP溶液浓度增加至0.10 mmol·L-1时CAT的活性增加至空白对照组(CK)的2.86倍，当SNP浓度继续增加至0.50 mmol·L-1时，CAT活性迅速下降。

注：不同小写字母表示各处理样品中CAT活性差异具有统计学意义(P<0.05)。图5 不同浓度的SNP对桔梗幼苗中CAT活性的影响(n=3)

2.3 不同浓度SNP对桔梗幼苗总皂苷含量的影响

桔梗总皂苷为桔梗植物的主要次生代谢产物，也是其起治疗作用的主要药效成分。图6所示，随SNP浓度的逐渐增加，桔梗幼苗(含胚轴的根部)总皂苷含量呈现先增加后减小的趋势。当SNP浓度为0.50 mmol·L-1时，皂苷含量最高，为对照组(CK)的1.84倍。当SNP浓度为1.00 mmol·L-1时，桔梗总皂苷的含量迅速降低。

注：不同小写字母表示各处理样品中桔梗总皂苷含量差异具有统计学意义(P<0.05)。图6 不同浓度的SNP对桔梗幼苗中总皂苷含量的影响(n=3)

3 讨论

3.1 NO对桔梗幼苗生长的促进作用

王金祥等[15]在拟南芥的研究中发现，施加外源性NO可以促进插穗生根和根的生长，推测适量NO有促进植物无性繁殖和营养器官建成的作用。尹丹丹等[16]发现适量的NO处理下的黄长筒石蒜的平均子球茎数、平均根数明显增加；本实验中低浓度SNP显著促进了桔梗幼苗生长，无论幼苗高度还是根系长度均与对照组(CK)有了明显的提高，但过高浓度SNP诱导下，促生长作用明显减弱，而且出现不同程度的胁迫伤害现象。这说明NO促桔梗幼苗生长具有浓度剂量效应，即低浓度促进、高浓度抑制，这与潘龙等[17]对紫花苜蓿的研究结果相似。

Pro是植物体内重要的渗透调节物质。本实验中，外源性NO可以显著增加桔梗幼苗中Pro含量，这说明在正常条件下生长的桔梗幼苗仍然可以通过施加适量的外源性NO增加Pro含量，以稳定植物体内的生物大分子，保护膜与酶的结构，促进和改善生长。

SOD、POD和CAT为植物体内重要的保护酶，而MDA则是反映植物受逆境伤害程度的重要指标。本实验中，当SNP浓度在0.03～0.10 mmol·L-1时保护酶SOD、POD和CAT的活性显著升高，而MDA含量则呈现降低的趋势。这说明SNP在较低浓度下，通过激活保护酶的活性，可以有效地清除植物体产生的活性氧自由基。从植物生长性状表现可以看出这一浓度范围内植物生长良好，且随SNP浓度增加植物根和茎长度均呈增加趋势，这说明SNP通过激活植物体内保护酶活性有效清除了植物体内活性氧，防止自由基对植物体产生的伤害，从而促进了植物的生长发育；而当SNP浓度增加到1.00 mmol·L-1时，幼苗中保护酶活性降低，活性氧平衡被打破，导致MDA含量显著增加，植物生长出现抑制。

3.2 NO对桔梗幼苗总皂苷诱导作用

桔梗皂苷类成分是桔梗重要的次生代谢产物。一般认为次生代谢产物是植物在进化过程中对不断变化的环境适应的结果。一些植物通过次生代谢应对外界环境刺激，例如有研究发现植物在盐碱、水分、温度等环境刺激下，次生代谢产物在其中发挥重要作用[18]。从本实验可以得出，一定浓度的SNP溶液能够促进桔梗幼苗(含胚轴的根部)皂苷类成分的合成，当SNP浓度是0.50 mmol·L-1时，桔梗总皂苷含量是空白对照组(CK)的1.84倍，但当浓度继续增加至1.00 mmol·L-1时，总皂苷含量有所下降。有研究表明，过量的NO能破坏植物的光合作用和电子链传递，造成DNA损伤和细胞死亡，抑制植物的生长发育，从而减少有效成分的合成[19]。总体上，SNP对桔梗总皂苷的影响表现在低浓度促进，高浓度抑制。

4 结论

较低浓度的SNP对桔梗幼苗生长有促进作用，0.50 mmol·L-1的SNP对桔梗幼苗(含胚轴的根部)中总皂苷诱导效果最强。