高效毛细管电泳指纹图谱法检测全蝎酶解液中蛋白类成分 (>10 kDa)的实验研究

2019-12-03张政孙志艺王涵琪王集会史磊

当代化工 2019年6期

张政孙志艺王涵琪王集会史磊

摘要：建立了用高效毛细管电泳指纹图谱法来检测全蝎酶解液中蛋白类成分（>10 kDa）的分析方法。采用未涂层弹性熔融石英毛细管柱（93 cm×0.75 μm），有效柱长为79 cm;二极管阵列检测器;50 mbar压力进样10 s;运行电压为-30 kV;柱温为20 ℃;运行时间为60 min;考察不同检测波长、缓冲溶液种类、pH、浓度等对色谱峰的影响，并对10批样品做了相似度评价。在缓冲溶液浓度为0.2 mol·L-1、pH=5.0硼酸缓冲溶液时响应值较高，谱图效果最好;检测波长为220 nm时出峰较多、吸收好，初步建立了以25个峰为共有峰的指纹图谱。结论：25个峰的高效毛细管电泳指纹图谱共有模式可以作为全蝎酶解液中蛋白类成分（>10 kDa）的鉴别方法。

关键词：高效毛细管电泳;蛋白;全蝎酶解液

中图分类号：R 284.2 文献标识码： A 文章编号： 1671-0460（2019）06-1144-05

Abstract： A method of protein detection of scorpion enzymolysis solution （>10 kDa） by HPCE was established. Elastic-uncoated-fused silica capillary column （93 cm×0.75 μm） with 79 cm effective column length was used as well as diode array detector， the sampling time at 50 mbar was 10 s， the operating voltage was 30 kV， the column temperature was 20 ℃， the operation time was 60 min.The effect of detection wavelength， buffer solution type， pH and concentration on chromatograms was investigated， meanwhile the similarity evaluation of 10 batches of samples was carried out. The results showed that， when 0.2 mol·L-1 borate with pH=5.0 was used as the buffer solution， the response value was higher， and the spectrum was the best. When the detection wavelength was 220 nm， the peak kinds was multiple and the UV absorbance was stronger， and the fingerprint spectrum of 25 peaks was established preliminarily. At last， it's pointed out that common model of HPCE chromatographic fingerprints of the 25 peaks can be used to detect the proteins of scorpion enzymolysis solution （>10 kDa）.

Key words： High performance capillary electrophoresis; Protein; Enzymolysis liquid of scorpion

動物药是我国传统中药中的重要组成部分，具有资源广、活性强、疗效独特的特点。经过长时间的研究发现，全蝎酶解液中的粗提混合物在体内对荷瘤小鼠（Lewise肺癌）的抑制率稍弱于西药对照药顺铂，而其超滤物蛋白类成分体内抗荷Lewise肺腺癌小鼠的活性强于顺铂常用量的疗效[1，2]，这一结果充分地证明全蝎酶解物冻干粉蛋白类成分具有较强的抗肺腺癌的活性，而且主要物质基础是蛋白多肽类物质，提纯物具有更高的药理活性，很有必要对其进行成份研究。

目前，中药成分分析的方法有很多，包括：高效液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）和高效毛细管电泳（HPCE）等色谱法[3]。其中，HPLC法最为常用，但用HPLC法进行中药成分分析有难以避免的缺点，像如分析时间长、分辩率低、色谱柱容易被污染，会严重影响分析结果的准确性[4，5]。

毛细管电泳（CE），亦称高效毛细管电泳（HPCE），是近十几年来迅速发展起来的一种分析方法。以是高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和（或）分配行为上的差异而实现分离的一种液相分配技术[6]。与传统的电泳技术和现代色谱技术相比，有以下几个特点：微量、高效、分析速度快、分析对象广、多模式、经济、环保。毛细管电泳具有多种分离模式，有多种功能，应用十分广泛，通常能配制成溶液或悬浮溶液的样品均能用CE进行分离和分析[7，8]。毛细管电泳的柱效与分子扩散系数成反比[9，10]，对于扩散系数小、分子量较大的蛋白多肽类物质的分析就有很大的优势，对中药资源的研究起到了无可替代的推动作用。为了更加精确的研究全蝎酶解液中抗肿瘤的蛋白类成分，特用高效毛细管电泳法来检测。

1 实验部分

1.1 仪器

Agilent 3DEC高效毛细管电泳仪，配有二极管阵列检测器;93 cm（有效柱长为79 cm）×0.75 μm未涂层弹性熔融石英毛细管柱。

1.2 试剂

全蝎酶解液冻干粉样品（分子量>10 kDa）由山东中医药大学化学实验室自制，硼砂，硼酸，磷酸，磷酸二氢钾，0.1 mol·L-1氢氧化钠。实验用试剂均为分析纯，实验用水均为纯净水。

2 方法与结果

2.1 供试品的制备

精密称取全蝎酶解液冻干粉（相对分子量>10 kDa）0.4 g，加6 mL纯净水溶解，于10 mL容量瓶中，加纯净水定容，用0.45 μm微孔滤膜滤过，滤液作为供试品[11]。

2.2 电泳条件

未涂层弹性熔融石英毛细管柱（93 cm×0.75 μm），有效柱长为79 cm;二极管阵列检测器;50 mbar压力进样10 s[2]; 运行电压为-30 kV;柱温20 ℃[3];供试品用相应的缓冲溶液稀释一倍。毛细管使用前依次用0.1 mol·L-1氢氧化钠、纯净水冲洗毛细管 5 min，再用缓冲液冲洗至基线平稳后开始进样，每两次进样之间设定缓冲液冲洗 5 min[12-14]。上述试剂使用前均用0.45 μm微孔滤膜滤过。

2.3 单因素考察

2.3.1 检测波长确定[4]

按照本实验2.2中的固定电泳条件，在0.2 mol·L-1的硼酸缓冲溶液;pH 5.0条件下，分别在波长220、245、280 nm进行测定，记录并分析不同波长条件下的色谱图，见图1。

结果显示，在检测波长为220 nm时吸收峰较多，强度适宜。故选将检测波长设为220 nm。

2.3.2 缓冲溶液种类的确定

按照本实验2.2中的固定电泳条件，在检测波长为220 nm;pH=5.0条件下，分别选用硼砂缓冲溶液[4]、硼酸缓冲溶液[15]、磷酸缓冲溶液[16]进样分析，观察色谱峰情况，见图2。

由图2可知，缓冲溶液为硼砂缓冲溶液时，色谱峰很少，强度很低;为磷酸缓冲溶液时，不出峰;为硼酸缓冲溶液时，色谱峰数目比前几种缓冲液要多，峰强度适宜。因此分析选择硼酸缓冲溶液比较好。

2.3.3 缓冲溶液浓度的确定

按照本实验2.2中的固定电泳条件，在检测波长220 nm;pH=5.0条件下，在选定硼酸缓冲溶液后，考察了不同缓冲液浓度（0.1、0.2、0.3 mol·L-1）对分离度的影响，见图3。

由图3可知，随着缓冲溶液浓度增加，色谱峰强度减弱，分析时间延长。综合谱图分析，选择0.2 mol·L-1硼酸缓冲溶液色谱峰形最好。

Fig.3 A （0.1 mol·L-1 boric acid buffer solution）， B （0.2 mol·L-1 boric acid buffer solution）， C （0.3 mol·L-1 boric acid buffer solution）

2.3.4 缓冲溶液pH的确定[4]

按照本实验2.2中的固定电泳条件，在0.2 mol·L-1的硼酸缓冲溶液;检测波长220 nm条件下，本实验考察了pH=5.5、5.0、4.5不同pH时的分离状况，见图4。

由图4可知，pH=5.5，出峰数目最少;pH=4.5次之;pH=5.0时最好。综合谱图分析，选择pH=5.0时色谱峰峰形，分离效果最好。

2.4 方法学考察[10，11，17]

2.4.1 稳定性实验

一份供试品配置后0、2、6、10、24 h按照本实验所选的最优实验条件进样分析，选择10号峰为参比峰，结果样品在24 h内，共有峰的相对迁移时间RSD<2.021%，相对峰面积RSD<3.001%，表明供试品在测定的24 h稳定。

2.4.2 精密度实验

取同一试样，按照本实验所选择的最优实验条件进样分析6次，选择10号峰为参比峰，计算共有峰的相对迁移时间RSD<2.217%，相对峰面积RSD<4.980%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重现性实验

取6份全蝎酶解冻干粉，按照本实验所选的最优实验条件进样分析，选择10号峰为参比峰，计算各峰的相对迁移时间、相对峰面积，计算RSD，计算出各峰的相对迁移时间RSD<2.972%，相对峰面积RSD<4.641%，证明本实验方法重现性好。

2.5 指纹图谱的建立[18，19]

根据十批次样品测定结果给出的峰数、峰面积和峰位（相对迁移时间）等相关参数进行系统的比较，确定优化的指纹图谱，见图5。

2.6 指紋图谱分析

2.6.1 共有指纹图谱的标定

2.6.2 相似度评价

取十批次已溶解的供试品于样品管中，按照本实验所选择的最优实验条件进样分析。比较十批次供试品的色谱图，应用EXCEL表格，对十批次进样数据分析，形成对照谱图，见图6。

经共有模式谱图计算相似度。见表1。

表1表明，本实验10批次进样得到谱图的相似度都在0.999左右，证明本实验10批次进样得到的谱图相似度好。

3 讨论

本实验重点研究了缓冲溶液对于分离的影响。本实验研究表明，采用在2.2中固有的实验条件下，采用检测波长220 nm;0.2 mol·L-1的硼酸缓冲溶液;pH=5.0时对全蝎酶解液蛋白类成分检测效果好，由本实验获得的高效毛细管电泳指纹图谱可以作为全蝎酶解液蛋白类成分（相对分子量>10 kDa）定性或定量的依据。

毛细管电泳技术的研究与应用，为药物分析、药物研究等领域带来了生机与活力，尤其是在中成药复方制剂的分析研究、中药材种属的鉴定和基因工程药物研究方面的进展迅速[3，4]，令人瞩目。

但毛细管电泳法也有难以完全改善的缺点。例如，毛细管柱内径很小，蛋白质易于吸附堵塞，另外虽然通过改变缓冲溶液可以减少蛋白质的吸附，但由于毛细管电泳分离模式的多样性，蛋白质吸附问题仍是亟待解决的问题之一。再有与HPLC相比，高效毛细管电泳存在重现性差的问题，虽然选择了比较优的实验条件，但实验结果对于蛋白质的定量分析远不如高效液相色谱法简便、重现性高。由于蛋白的相对分子质量大，不同蛋白的等电点也不相同，pH值改变，相对应的蛋白的电泳方向可能也会发生改变，所以高效毛细管电泳法在目前来说并不是最优的蛋白定量方法。

虽然如此，毛细管电泳技术在中药复方制剂研究中仍发挥着重要的作用，随着科技的不断发展，相信毛细管电泳技术应用将会更加广泛。

参考文献：

[1]刘颖，朱晓明，王彦多，曹广超，施东方，吕迎兰，王集会，史磊.正交实验优化美洲大蠊粉混合酶酶解工艺[J].当代化工， 2018， 47 （06）： 1131-1134.

[2]冯成强，张文生，崔光红，黄璐琦. 半夏及其混淆品水半夏的蛋白高效毛细管电泳法鉴别[A]. 中国中医科学院.中医药发展与人类健康——庆祝中国中医研究院成立50周年论文集（下册）[C].中国中医科学院：，2005：2.

[3]刘婷，姜金斗，刘宁. 毛细管电泳检测奶粉中添加的大豆分离蛋白[J]. 分析科学学报，2008（01）：37-41.

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