宋丹丹，王 龙，魏红静，史文竞，朱传坤

( 淮阴师范学院 生命科学学院，江苏省特色水产繁育工程实验室，江苏省区域现代农业与环境保护协同创新中心，江苏 淮安 223300 )

克氏原螯虾(Procambarusclarkii)，俗称小龙虾，属节肢动物门、甲壳动物亚门、十足目、蝲蛄科、原螯虾属，原产于北美，后经日本引入我国[1]。克氏原螯虾具有生长迅速、生命力强、数量增长快、耐运输、易销售、市场价值高等优点，成为我国重要的水产经济物种[2]。除具有很高的食用价值之外，克氏原螯虾虾壳中富含钙、磷、铁等多种重要营养元素，可以加工为饲料添加剂；此外，从虾壳中提取的虾青素、甲壳素制备的壳聚糖等也是重要的工业原料，在多个领域中广泛应用[3]。

微卫星又称简单序列重复，它是由少数几个核苷酸(大多数为2～6个)为单位多次串联重复的DNA序列，根据串联重复是否连续，微卫星序列可以分为完美型、非完美型和复合型3类[4]。微卫星标记具有分布广泛、多态性高、PCR扩增简单、节约样品、易检测、共显性等优点，已在多种水生生物群体遗传结构分析[5]、亲子鉴定[6]、遗传图谱构建及数量性状位点定位[7]等研究中得到广泛应用。常用的微卫星获取方法主要包括：从公共数据库获取，从近缘物种跨种筛选及从基因组中自主开发等[8]。目前，克氏原螯虾中已有微卫星标记开发的报道[9-10]，但是数量仍然较少，无法满足当前的研究需求。因此，本研究拟采用磁珠富集法构建克氏原螯虾微卫星富集文库并筛选多态性微卫星标记，以期为今后克氏原螯虾及其近缘物种的遗传学研究及分子标记辅助育种提供有利工具。

1 材料与方法

1.1 基因组DNA提取及检测

试验用41尾克氏原螯虾样本均购于江苏省常州市集贸市场，每尾个体取肌肉组织置于2 mL离心管中，加入无水乙醇后保存在4 ℃冰箱中备用。基因组DNA提取采用苯酚—氯仿法进行。用1%琼脂糖凝胶电泳及NanoDrop2000型微量紫外分光光度计进行DNA质量检测，并将DNA稀释为50 ng/μL备用。

1.2 基因组酶切及片段回收

取1尾克氏原螯虾DNA样本1.5 μL，加入Mse-I限制性内切酶，于冰上混匀后在37 ℃水浴中酶切2 h，酶切完毕后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。将等体积的MseI-1(5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′)和Mse-2(5′-TACTCAGGACTCAT-3′)接头混合后，在95 ℃条件下变性5 min后缓慢冷却至室温，制备成Mse-I接头。用T4 DNA连接酶将Mse-I接头和酶切产物于16 ℃恒温生化培养箱中过夜连接。

将连接产物稀释10倍后作为模板，以MseI-N(5′-GATGAGTCCTGAGTAAN-3′)作为引物，进行预扩增。预扩增反应体系如下：总体积为25 μL，包含10×PCR Buffer(不含Mg2+)2.5 μL，MgCl21.6 μL，dNTPs 0.4 μL，MseI-N 0.8 μL，DNA模板1.0 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL。为确定最佳预扩增效果，在进行PCR反应过程中，设置了20、22、24、26和28共5个不同循环梯度，PCR反应程序如下：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，72 ℃终延伸20 min。预扩增完成后，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测各循环梯度的扩增效果，确定最佳循环数。循环数确定后，将PCR反应体系扩大至50 μL，依照上述PCR程序设定及最佳循环数进行PCR扩增，并对扩增产物进行纯化回收。

1.3 生物素探针杂交

取“1.2”中回收产物29 μL与70 μL杂交液(6×SSC+0.1% SDS)混合，加入生物素标记的(GT)13探针1 μL，配制成100 μL杂交反应混合液。杂交反应在PCR仪中进行，程序设定如下：95 ℃变性5 min，65 ℃退火1 h，缓慢降温至室温，使混合液充分杂交。

1.4 磁珠富集

吸取150 μL链霉亲和素包被的磁珠于1.5 mL离心管中，于室温下用300 μL TEN100溶液洗涤3次，每次洗涤5 min，之后，向含磁珠的管内加入300 μL TEN100溶液及“1.3”中所得杂交产物混匀，室温下静置30 min后，用磁力架固定磁珠并弃去杂交混合液。加入400 μL TEN100溶液对磁珠进行3次非严谨洗脱，每次5 min。再用400 μL 0.2×SSC和0.1% SDS混合的洗涤液对磁珠进行3次严谨洗脱，每次5 min。最后向管中加入50 μL pH8.0的TE缓冲液，并在100 ℃沸水中水浴5 min，得到第一次洗脱片段，重复该操作一次，获得第二次洗脱片段，对两次洗脱产物进行电泳检测。

1.5 洗脱片段预扩增及纯化

对得到的洗脱产物进行预扩增，预扩增体系与PCR程序设定同“1.2”，扩增30个循环。根据琼脂糖凝胶电泳后的结果选择第二次洗脱产物并利用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化。

1.6 目的片段克隆及阳性检测

将“1.5”中所得纯化产物连接到pMD18-T载体后转化入DH5α感受态大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞，并涂布在含氨苄青霉素的固体LB培养基上于37 ℃培养16 h。

用无菌牙签挑选单个克隆于含氨苄青霉素的50 μL液体LB培养基的离心管中，在37 ℃恒温摇床中以200 r/min速度振荡培养24 h。利用通用引物M13对培养的各克隆进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测，挑选出片段大小在250～800 bp的克隆送至武汉艾康健生物技术有限公司测序。

1.7 同源序列查找

将各克隆测序所得序列在GenBank(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov)中利用BLASTn进行同源序列比对，当E值小于10-10时，认为是同源序列，当序列有多个同源序列时，取E值最低的序列作为相应克隆的同源序列。

1.8 微卫星引物设计及多态性筛选

克隆测序完成后，利用SSRHunter软件从已获得的序列中查找微卫星序列，并辅以人工校对。对于含微卫星的片段，通过Primer premier 5.0软件设计引物并送生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。合成的引物在10尾克氏原螯虾中进行扩增效果检测与多态性筛选。将筛选出的多态性引物在含有30尾个体的克氏原螯虾群体中进行多态性特征分析。检测过程中所用PCR反应体系总体积为12.5 μL：包括10×PCR buffer(含Mg2+)1.3 μL，dNTPs 0.4 μL，上、下游混合引物 0.4 μL，DNA模板 1 μL，Taq DNA聚合酶 0.1 μL，无菌超纯水9.3 μL。PCR扩增产物用10%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，经GoldviewⅠ型染色剂染色后通过紫外凝胶成像系统成像，并以Super DNA marker的梯度大小为标准，判断各微卫星标记的等位基因，并将分型数据输入Excel表格中备用。

1.9 多态性数据分析

利用Arlequin 3.01软件分析各多态性微卫星标记的等位基因数、期望杂合度、观测杂合度、连锁不平衡以及哈迪—温伯格平衡的偏离情况，所涉及参数的显著值通过Bonferroni法进行校正[11]。此外，多态信息含量采用基于Excel的软件MS-TOOLS[12]进行计算，而标记中的潜在零等位基因则利用软件Micro-Checker 2.2.3[13]进行预测。各软件分析多态位点分型数据时所涉及的格式转换均通过CONVERT软件进行。

2 结 果

2.1 微卫星富集文库阳性克隆检测

本研究中所构建的克氏原螯虾微卫星富集文库获得克隆约1000个，随机选择其中的82个克隆进行阳性检测(图1)。检测结果显示，挑选的克隆中含阳性单克隆75个，阳性双克隆3个，假阳性克隆4个，因此，该文库的阳性率达到95.1%。

图1 克氏原螯虾微卫星富集文库部分克隆电泳检测图1～24号为克隆泳道，M为Marker.

2.2 微卫星富集效率

将检测出的75个阳性单克隆送交武汉艾康健生物科技有限公司测序后，有8个克隆因质粒抽提失败未进行测序，另外的10个因含有高级结构而未能成功测序，因此，成功测序的克隆有57个。在这57条克隆序列中，含微卫星重复序列的有43条，因而本文库的微卫星富集效率为75.4%。

2.3 微卫星特征分析

在含有微卫星的43条序列中，完美型微卫星序列有25条(58.1%)，非完美型序列有8条(18.6%)，复合型序列有7条(16.2%)，3条为重复单元大于6碱基的小卫星序列(7.0%)(图2a)。在测得43条微卫星序列中共含51个微卫星位点，平均每条序列含1.2个，33条(76.7%)序列中含一个微卫星位点，10条(23.3%)序列含一个以上微卫星位点，最多的序列具有3个微卫星位点(图2b)。

本研究中所用的探针重复类型为GT，因而获得的微卫星序列重复单元多为CA/AC与GT/TG(66.7%)，但也有GA、ACC等其他碱基重复类型(图2c)，甚至还有以13、38和30碱基为重复单元的3条小卫星序列(图2a)。在51个微卫星位点中，重复次数最少为4次，最多为161次，有22个位点(43.1%)重复次数大于10次，其中有10个(19.6%)重复次数大于20次(图2d)。

图2 克氏原螯虾文库所得微卫星基本情况a：不同类型微卫星分布情况；b：序列所含微卫星位点个数分布；c：微卫星不同重复单元分布情况；d：微卫星重复次数分布情况.

2.4 同源序列查找

在美国国立生物技术信息中心上将克隆所得的57条序列通过BLASTn搜索，共匹配出12条同源序列，匹配相似度为87%～100%(表1)。其中，克隆PcGT01序列与信号小龙虾(Pacifastacusleniusculus)血小板衍生生长因子(PDGF)和血管内皮生长因子(VEGF)相关受体1(PVR1)mRNA同源；克隆PcGT12序列与曼氏血吸虫(Schistosomamansoni)的微卫星序列具有较高同源性；克隆PcGT08、10、36和48与克氏原螯虾中已发表的部分微卫星序列同源，而PcGT02、14、15、16、17和20序列则与克氏原螯虾中的部分基因序列同源(表1)。这在今后的应用过程中将具有重要参考价值。

表1 克氏原螯虾克隆序列同源序列查找结果

2.5 微卫星引物设计及多态性筛选分析

在含微卫星位点的43条序列中，有22条侧翼序列太短或者是GC含量过低，无法设计引物，最终，对剩余的21条序列设计了引物(表2)。将这21对引物在10尾克氏原螯虾中进行PCR及电泳检测，结果表明，这21对引物中的18对可扩增出稳定、清晰的条带，其中有9对表现出良好的多态性，多态性比例为50%(表2)。

表2 本研究所设计克氏原螯虾微卫星引物的基本信息及检测结果

续表2

引物名称GenBank号引物序列(5′→3′)产物大小/bp退火温度/℃是否成功是否多态PcGT08MH998135F:GCTATTGAGATGTGCCATTGR:TGTTGATTGACAGTTGCGAG10851是否PcGT09MH998136F:AGTAGTGATACATACAACACAGCR:TAACCCCCTGACCTAACCTA14149是是PcGT10MH998137F:TCACATGAACAACCAAAGAATR:ATGACAGAACCCGATAGGC22351是是PcGT11MH998138F:GTCTGCTTGCCTGGGAGTATR:TCGTTCACACAGCTGTAACATG26654是否PcGT12MH998139F:TGATTGACAGTTGAGAGGCGR:CAAGCAAGGCTGGTTCATC42054否否PcGT13MH998140F:GCAGAATACCCCCGTTGAR:TGTGTAGTGGAAGCGTGTTG10251是否PcGT14MH998141F: TGTCCCACACTTTGCTTCCR: GCCATTCCCATCACCACTA21352是否PcGT15MH998142F: CCTATCACGAAACCTCCTGTR: CCTGCCATCCTTAAACCTAC17852是是PcGT16MH998143F: AACTGTCGGCAAGTAAGGTGR: AGGTGCTCAGAAGTGCGTAG30656否否PcGT17MH998144F: CTGTCGCCATTCCATTGTGTR: TAAACTCCCCCCTCATCTACTG22850是是PcGT18MH998145F: GGGTGGCGTCCTTGATTGATR: ATTTGGCGGGTAGGTCTCTCC17255是否PcGT19MH998146F: GACAACACCATCACGGGCTCR: CTTCCACAGTAGCAAGGTCTCG28657否否PcGT20MH998147F: TATTCTTCCCCATTTTGTCCR: TTTGCCCCATATCTAAGTCAT18952是是PcGT21MH998148F: GTTGATTGACGGTTGAGAGR: TAATCTACCTGGTCTGTTGC15752是是

2.6 多态性标记特征分析

筛选所得9个微卫星标记共得到等位基因36个，其中PcGT15和PcGT21等位基因数最多，均为6个；PcGT03和PcGT10只获得了较少的两个等位基因(表3)。9个多态位点的平均观测杂合度为0.5856，其中PcGT17的最高(0.6667)，其次为PcGT15(0.6000)，而PcGT10的最低(0.3522)(表3)；平均期望杂合度为0.6291，其中最高的为PcGT21(0.8390)，最低的为PcGT10(0.3704)(表3)。多态信息含量最高为PcGT21中的0.8001，最低为PcGT10中的0.2859(平均为0.5584)，其中PcGT07、PcGT15、PcGT17、PcGT20和PcGT21的多态信息含量大于0.5，表明这些位点具有高度多态性，其余4个标记表现出中度多态性(表3)。通过Bonferroni校正后，PcGT03、PcGT07和PcGT21仍然偏离哈迪—温伯格平衡(P<0.01)(表3)。连锁不平衡分析结果经Bonferroni校正后(P<0.001)未发现标记间的连锁现象。通过Micro-Checker软件检测的结果显示，标记PcGT07、PcGT17、PcGT20和PcGT21中可能存在零等位基因。

3 讨 论

3.1 微卫星富集效果与组成特征

在真核基因组中，微卫星广泛分布，其中重复类型为(CA)n或是(GT)n的含量尤为丰富，如中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)[14]、日本蟳(Charybdisjaponica)[15]等。与先前的研究报道类似，本研究获得的微卫星重复单元以CA/AC和GT/TG为主，但同时也发现了GA、ACC和TAACC等其他重复类型。目前，微卫星分子标记技术已广泛应用于水产动物的遗传学和分子生物学研究中，如陈万光等[16]用微卫星标记分析及检测一个日本锦鲤(Cyprinuscarpiokoi)人工养殖群体的遗传多样性。孙成飞等[17]利用微卫星分子标记技术比较了中、泰两国罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)养殖群体的遗传结构及遗传多样性。朱传坤等[18]构建了鳙鱼(Aristichthysnobilis)的微卫星标记遗传连锁图谱。

表3 克氏原螯虾9个微卫星位点多态性分析

注：*表示偏离哈迪—温伯格平衡.

获取微卫星标记的方法有多种，目前常用的有从公共数据库获取微卫星分子标记、从近缘物种中获取微卫星标记及从基因组中自主开发新的微卫星标记这3种方法。从公共数据库中获取微卫星标记较为简单方便，但公共数据库中包含的物种微卫星标记数据量较少，覆盖面低，具有一定局限性；微卫星序列包含侧翼序列及核心序列，核心序列的重复次数决定了微卫星的多态性，侧翼序列则具有保守性，因此已获得的微卫星标记可用于近缘物种的研究分析，如部分牛微卫星标记在羊的基因组中也表现出多态性[19]，鲤鱼微卫星标记在鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)中跨种应用[20]等。尽管上述方法操作简便、成本低，但由于可用数据信息较为有限，无法大量筛选所需标记。因此，最主要的方法是从目标物种基因组中自主开发微卫星标记，其中磁珠富集法获得微卫星标记的效率较高，已在多种水产动物中成功应用[21-22]。

本研究采用生物素标记的(GT)13探针与扩增片段杂交，通过磁珠富集法来构建微卫星富集文库，构建出的文库中有57个克隆测序成功，阳性克隆率为95.1%，高于多种已报道水产动物中的阳性率[15,21,24]。影响阳性克隆率的因素有很多，如不同研究者操作程序、物种、基因组质量、连接产物回收纯化效果等差异均会影响磁珠富集效率。在测序成功的57个克隆中有微卫星序列43条，因而微卫星富集效率达到了75.4%，其中完美型序列占比最大，达到了58.1%，非完美型占18.6%，复合型序列占16.2%，这与乌苏里拟鲿(Pseudobagrasussuriensis)[22]、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)[23]、合浦珠母贝(Pinctadafucata)[24]、中国鲎(Tachypleustridentatus)[25]等的微卫星数据类似。

3.2 微卫星多态性

一般微卫星重复次数越多，反映出该位点的多态性也就越高[4]，在本研究获得的51个微卫星位点中，有22个(43.1%)位点重复10次以上，其中有10个(19.6%)重复次数高于20次，表明克氏原螯虾基因组中存在较多潜在的多态性微卫星位点。最终18对能够扩增出稳定条带的引物中，多态性比例达到了50%，比先前报道的多种水产动物的多态性比例都高[21-22]。多态信息含量能够反映出一个遗传标记的多态性信息量，当多态信息含量>0.5时，为高度多态性；多态信息含量为0.25～0.5时，为中度多态性[26]。本研究所得9个多态位点中有5个位点表现为高度多态性，其余4个为中度多态性，这也预示着这些多态性标记将成为今后克氏原螯虾遗传学分析的有力工具。

零等位基因一般是由微卫星引物结合位点突变或缺失阻碍了微卫星的扩增造成的[27]，其对相关研究结果的影响尚不清楚，大部分研究将其直接用于结果的分析[28]。一般情况下，零等位基因可通过哈迪—温伯格平衡检验法或零等位基因检测软件如Micro-Checker等检测出来。本研究所得9个多态标记中，PcGT03、PcGT07和PcGT21显著偏离哈迪—温伯格平衡，而PcGT07、PcGT17、PcGT20和PcGT21中可能存在零等位基因，因此，PcGT07和PcGT21偏离哈迪—温伯格平衡可能是零等位基因所致。然而，另外一个偏离哈迪—温伯格平衡的标记PcGT03中未检测出零等位基因，而符合哈迪—温伯格平衡的两个标记PcGT17和PcGT20中反而检测出零等位基因，这说明零等位基因的产生机制较复杂，有待更加深入的研究来解释。

此外，本研究所得57条克隆序列中共检索出12条匹配程度较高的同源基因，这些同源分析结果将为丰富克氏原螯虾的基因组序列信息及进一步的遗传分析提供参考。

4 结 论

本研究得到以下结论：(1)采用磁珠富集法构建克氏原螯虾微卫星文库切实可行；(2)从克氏原螯虾富集文库中开发的微卫星标记多态性比例较高，而且均表现为中度及高度多态性。