刘丽丽，王晓雯，朱建亚，张 蓉，朱 华，田照辉

( 北京市水产科学研究所，渔业生物技术北京市重点实验室，北京 100068 )

热激蛋白(HSP)是一类在不同生命形式间高度保守的蛋白质[1]，能够抵御环境压力、促进细胞生长[2]。热激蛋白家族根据蛋白序列同源性和分子质量，可以分为HSP40、HSP70、HSP90、HSP100和HSP110等，其中HSP70蛋白主要以胞内分子伴侣的形式参与蛋白质折叠和转运，在细胞生长、存活和凋亡过程发挥关键作用[3-4]。部分Hsp70基因没有内含子，这使得开始启动转录就可产生成熟的mRNA以适应Hsp70基因大量快速表达的需要，阻止应激源对其mRNA前体的影响[5]，这促进了HSP70蛋白作为环境胁迫分子标志物的研究。在温度刺激、重金属胁迫、自由基攻击和微生物感染等环境下，HSP70蛋白能够迅速并准确响应，因此作为响应外界环境刺激的生物标志物得到深入研究[3]。

鱼类属于变温动物，极易受温度等环境影响，HSP蛋白在鱼类应对温度变化过程中发挥关键作用[6]。虎皮鱼(Puntiustetrazona)原产于印度尼西亚的苏门答腊岛、加里曼丹岛和马来西亚的内陆水域，体型为典型的纺锤形，侧扁，长5～7 cm。体表浅黄色，上覆四条垂直的浓黑色条纹，似虎纹，故名虎皮鱼。虎皮鱼吻部和各鳍呈红色，相映成趣，群游，性情活泼、行动敏捷，是广受市场欢迎的小型热带鱼。虎皮鱼是狭温热带鱼类，对温度变化十分敏感，适宜水温为23～28 ℃，温度降低则影响其繁殖、摄食和生存。HSP70蛋白是鱼类中研究广泛的一类热激蛋白。目前已从广温鱼类草鱼(Ctenopharyngodonidella)[3]、鲤鱼(Cyprinuscarpio)[7]、齐口裂腹鱼(Schizothoraxprenanti)[8]、团头鲂(Megalobramaamblycephala)[9]、莫桑比克罗非鱼(Oreochromismossambicus)[10]、达氏鳇(Husodauricus)[11]等，冷水鱼类施氏鲟(Acipenserschrenckii)[12]、银海鲷(Sparussarba)[13]等和少数热带鱼类斑马鱼(Daniorerio)[14]、黄雀鲷(Pomacentrusmoluccensis)等扩增到Hsp70基因的cDNA序列，但是Hsp70基因在虎皮鱼体内的序列结构和表达机制尚未见报道。

在前期转录组数据分析中发现，虎皮鱼Hsp70(PtHsp70)基因mRNA水平可能受到低温胁迫的影响(数据待发表)。为此，笔者克隆PtHsp70基因cDNA的完整编码序列，分析序列同源性，预测其编码氨基酸序列结构，通过qRT-PCR技术检测分析PtHsp70基因在不同组织中的特异性表达，分析低温胁迫下PtHsp70基因表达水平的变化，探明PtHsp70基因在成年虎皮鱼体内存在的表达特征。

1 材料和方法

1.1 虎皮鱼梯度低温胁迫试验

试验用虎皮鱼购自虎皮鱼渔场(山东枣庄)，在本实验室完成驯化，并长期养殖。实验室养殖条件为：水温25～27 ℃，pH 6.5～7.4，kH 6～7，24 h不间断通氧，水体循环过滤，每日喂食商品干饲料2次。

挑选体型大小相近、健康活泼的8月龄虎皮鱼150尾，用于梯度低温胁迫试验。将150尾虎皮鱼随机分为5个养殖缸，每个养殖缸30 L，含有30尾虎皮鱼。试验第1 d水温保持为27 ℃，次日起每24 h降低温度如下：△T1=4 ℃/d，△T2=4 ℃/d，△T3=4 ℃/d，△T4=2 ℃/d，其他条件维持不变。直至水温降至13 ℃，继续处理24 h，结束低温胁迫试验。每个温度处理结束后，每缸随机取3尾虎皮鱼，立即解剖用于总RNA提取，试验共5个生物学平行。

1.2 总RNA提取

分别对27、23、19、15、13 ℃处理24 h后的虎皮鱼提取总RNA。间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐麻醉后，解剖分别取其脑、鳃、肝脏和肌肉组织，同种组织混合存放，立即使用RNAiso Plus(TaKaRa公司，D9108A)试剂提取总RNA，操作按照试剂说明书进行。Nanodrop2000核酸蛋白浓度检测仪测定总RNA含量和污染情况，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，-80 ℃保存备用。

1.3 cDNA第一链合成与保守序列克隆

以各组织总RNA为模板，采用1st strand cDNA合成试剂盒(TaKaRa公司，6110A)合成cDNA第一链，操作方法按照试剂说明书进行。Nanodrop2000核酸蛋白浓度检测仪测定cDNA合成产物浓度，-80 ℃保存备用。根据GenBank中报道的鱼类Hsp70基因cDNA保守序列，设计引物HSP70CDS-F和HSP70CDS-R(表1)，Ex Taq酶(TaKaRa公司，DRR001A)PCR扩增获得PtHsp70基因cDNA部分序列。PCR产物琼脂糖凝胶电泳验证后送交擎科新业生物技术公司进行测序。

1.4 RACE克隆

基于得到的PtHsp70基因cDNA部分保守序列，Primer3Web(http:∥primer3.ut.ee/)在线设计引物HSP70-GSP1和HSP70-GSP2，用于5′RACE和3′RACE。采用SMARTer RACE 5′/3′ Kit(Clontech，634858)试剂盒，按照说明书配制反应体系，进行PCR扩增，分别克隆得到PtHsp70基因cDNA的5′和3′ RACE产物。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，凝胶DNA回收试剂盒(TaKaRa公司，9762)回收目的条带DNA，送交擎科新业生物技术公司进行测序，采用SeqMan软件对测序片段与得到的PtHsp70基因cDNA部分保守序列进行拼接。

1.5 序列结构分析

拼接序列经Blastn在线(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对，结果表明该序列与美国国立生物技术信息中心数据库公布的Hsp70基因mRNA序列具有高度同源性；使用Clustal X 2和DNAMAN软件进行序列同源性比对，ORF Finder在线(http:∥www.expasy.ch/tools/)预测开放阅读框和编码氨基酸序列。BLASTP在线(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)进行氨基酸序列比对和结构分析(数据库：CDSEARCH/cdd v3.16 ，2018年4月26日)。

1.6 实时荧光定量qRT-PCR

以本研究中获得的脑、鳃、肝脏和肌肉组织cDNA为模板，根据获得的PtHsp70基因cDNA序列，Primer3Web(http:∥primer3.ut.ee/)在线设计引物HSP70-qF和HSP70-qR用于荧光定量PCR(表1)。荧光定量PCR试验以虎皮鱼Gapdh基因为内参基因，使用天根荧光定量PCR试剂盒(FP209)，ABI StepOne Plus仪器收集荧光信号。

2 结 果

2.1 PtHsp70基因cDNA全序列结构分析

本研究克隆到的序列经过测序、拼接和序列比对，发现与斑马鱼、鲤鱼、鲫鱼(Carassiusauratus)、光唇鱼(Acrossocheilusfasciatus)和齐口裂腹鱼Hsp70基因cDNA全序列的相似度分别为94%、91%、91%、91%和90%，确认该序列为PtHsp70基因cDNA序列(表2)。全长2317 bp，其中5′非编码区长120 bp，3′非编码区长266 bp，编码区长1932 bp，对应的开放阅读框为121～2052 bp，编码643个氨基酸。

表1 本研究所用引物信息表

表2 PtHsp70基因cDNA序列BLAST比对结果

将PtHsp70基因编码区与鲤鱼、鲫鱼、斑马鱼Hsp70基因编码区序列进行多序列比对，发现其序列相似性为95.43%(图1)，表明PtHsp70基因编码序列高度保守。

2.2 氨基酸序列预测与结构分析

研究预测PtHsp70基因cDNA序列共翻译643个氨基酸，其中亲水性氨基酸215个，疏水性氨基酸161个，虎皮鱼HSP蛋白分子量为70.54975 ku，等电点为5.375(图2)。SMART分析显示，虎皮鱼HSP蛋白氨基酸序列含有典型的蛋白结构域coiled coil(514～536 aa)。

虎皮鱼HSP70蛋白的氨基酸序列包含典型的热激蛋白保守结构域，例如核苷酸结合结构域、底物结合结构域(SBD)、BAG/HSP70结合位点、NEF/HSP70结合位点等(图3)。虎皮鱼HSP70蛋白氨基酸序列与已经公布的HSP70蛋白质一级序列具有高度相似性(表3)，表明PtHsp70基因高度保守。

2.3 PtHsp70基因mRNA组织特异性与温度诱导表达

荧光定量PCR结果表明，PtHsp70基因mRNA在成年虎皮鱼的脑、鳃、肝脏和肌肉组织中的表达水平各不相同(图4a)。在脑组织中，PtHsp70基因mRNA含量最低，鳃组织PtHsp70基因mRNA含量是脑组织的2.1倍(P<0.01)，肌肉组织PtHsp70基因mRNA含量是脑组织的19.8倍(P<0.01)，虎皮鱼肝脏组织中PtHsp70基因mRNA含量最高，是脑组织的78.8倍(P<0.01)。研究表明，PtHsp70基因mRNA在虎皮鱼体内的表达水平具有明显的组织特异性，表达水平依次为肝脏>肌肉>鳃>脑(图4a)。

在低温胁迫环境下，虎皮鱼脑、鳃和肌肉组织PtHsp70 mRNA水平均表现为显著上调(图4b)。其中，脑组织PtHsp70基因mRNA水平在15、13 ℃条件下分别为对照组的15.3、18.6倍(P<0.01)；鳃组织PtHsp70基因mRNA水平在15、13 ℃条件下分别是对照组的2.8和5.3倍(P<0.01)；肌肉组织19、15、13 ℃处理组PtHsp70基因mRNA水平分别是对照组的8.8、10.9和15倍(P<0.01)。而在肝脏组织中，随着温度降低，PtHsp70基因表达水平呈先降后升的趋势，当温度至23 ℃和19 ℃时，mRNA水平与对照组相比变化不显著，当温度继续降至15 ℃时，mRNA水平仅为对照组0.4倍，温度继续降至13 ℃时，PtHsp70基因mRNA表达水平反而呈上升趋势，是对照组的1.5倍(P<0.01)。

图1 Hsp70基因cDNA序列比对结果

图2 虎皮鱼HSP蛋白氨基酸序列预测

图3 虎皮鱼HSP70蛋白氨基酸序列保守结构预测

名称登录号描述序列位置E值PTZ00009PTZ00009热激蛋白70 ku3～6430e+00HSP70pfam00012HSP70蛋白8～6140e+00HSPA1-2_6-8-like_NBDcd10233HSPA1-A/-B/-L/HSPA-2等的核苷酸结合结构域8～3830e+00prok_dnaKTIGR02350细菌分子伴侣蛋白DnaK (HSP70蛋白)8～6140e+00DnaKCOG0443大肠杆菌分子伴侣DnaK (HSP70蛋白) 1～6140e+00

图4 PtHsp70基因转录本表达水平定量分析a.虎皮鱼脑、鳃、肝脏和肌肉组织PtHsp70基因mRNA表达水平定量分析，其中以脑组织为对照组，所有样品处理温度均为27 ℃；b.低温胁迫下虎皮鱼各组织PtHsp70基因mRNA表达水平定量分析，每个组织中以27 ℃处理组作为对照组. 图中所有数值表示为平均值±标准差. *表示与对照组有显著差异(P<0.01).

3 讨 论

3.1 PtHsp70基因cDNA与氨基酸序列

HSP70蛋白家族被两种不同的基因编码，一种是组成型的Hsc70基因，一种是诱导型的Hsp70基因，两种基因的编码蛋白均作为分子伴侣发挥重要作用，通常认为诱导型Hsp70基因在机体和细胞应对温度胁迫的过程中发挥关键作用[13]。鱼类中也存在组成型和诱导型的HSP70蛋白，特别是在冷水鱼类和极地鱼类中，普遍存在两种类型的HSP70蛋白，分别被组成型Hsc70基因和诱导型Hsp70基因编码[15-17]。而在热带鱼类和温带鱼类中发现的HSP70蛋白与其他脊椎动物中发现的热诱导型HSP70蛋白高度同源，相似性达到75%～80%，因此普遍认为鱼类HSP70蛋白属于热诱导型HSP70蛋白家族[18]。本研究克隆到含有完整编码区的虎皮鱼Hsp70(PtHsp70)基因，其cDNA序列高度保守，与斑马鱼、鲤鱼、鲫鱼、光唇鱼等鲤科鱼类的Hsp70基因cDNA序列相似度超过90%，其中与斑马鱼相似度最高(94%)，因此推测本研究克隆到的PtHsp70基因cDNA与斑马鱼、鲤鱼、鲫鱼等的Hsp70基因同源。本研究预测PtHsp70基因cDNA序列共翻译643个氨基酸，全序列包含典型的热激蛋白保守结构域，例如核苷酸结合结构域、底物结合结构域、BAG/HSP70结合位点、NEF/HSP70结合位点等。

3.2 PtHsp70的组织特异性表达

当受到外界刺激时，细胞中组成型Hsc70基因转录本水平不变或略有上升，而诱导型Hsp70基因从本底水平被大幅诱导表达，这一过程由热激因子1(HSF1)三聚体结合到Hsp70基因启动子区域介导[13]。本研究检测了PtHsp70基因在虎皮鱼不同组织中的本底表达水平，发现PtHsp70基因表达水平具有组织特异性，在肝脏和肌肉中的表达水平高于脑和鳃组织。

本研究中，虎皮鱼肝脏PtHsp70基因mRNA本底表达水平非常高，是脑组织的78.8倍，表明PtHsp70基因在虎皮鱼肝脏中有较高的本底表达水平。此前曾有报道，在伯氏肩孔南极鱼(Trematomusbernacchii)、博氏南冰(Pagotheniaborchgrevinki)、南极绵鳚(Lycodichthysdearborni)等南极抗冻鱼中[19]，Hsp70基因普遍表现为高水平的组成型表达，从而在鱼类应对长期低温环境中发挥重要作用。HSP蛋白主要发挥分子伴侣的作用，帮助蛋白折叠[20]，辅助多聚蛋白复合体组装和解聚[21]，参与蛋白转运[22]和降解[23]，参与信号转导[24]等。当HSP70蛋白处于二磷酸腺苷结合态时，对多肽底物有高亲和力，结合多肽底物；而当HSP70蛋白处于三磷酸腺苷结合态时，与底物的结合能力减弱[25-26]。由此推测，虎皮鱼肝脏PtHsp70基因高水平本底表达模式是为适应肝脏作为主要代谢器官，及时应对各种环境胁迫的需要。

3.3 低温胁迫下PtHsp70的诱导型表达

HSP70蛋白作为分子伴侣，帮助初级多肽链正确折叠，介导变性蛋白质的修复和降解，在帮助细胞应对环境刺激的过程中发挥重要作用[27-29]。广温性鱼类可能通过调控HSP70蛋白表达，适应栖息环境温度变化，以抵御低温胁迫造成的细胞和组织损伤，例如尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)[30]和南亚野鲮(Labeorohita)[31]肌肉组织Hsp70基因mRNA水平在低温刺激后显著上升；同样，低温刺激下斑点叉尾(Ictaluruspunctatus)脑组织Hsp70基因表达上调[32]，达氏鳇鳃组织Hsp70基因mRNA水平随着温度降低而逐渐升高，4 ℃时达到峰值[11]。Hsp70基因转录本水平上升意味着组织中HSP70蛋白合成增加，以抵御细胞损伤和凋亡。

而在狭温性鱼类中，对HSP70蛋白及其编码基因的研究还比较少。南极鱼类生活在稳定的低于-1.9 ℃的环境中，温度升高(5～6 ℃)时未检测到HSP蛋白表达；黄雀鲷是一种狭温性热带珊瑚鱼，高温(34 ℃)胁迫下，Hsp70、Hsp90、Hsp40等Hsp基因mRNA水平无显著变化[33]。因此过去认为冷水性狭温鱼类可能缺失HSP蛋白[34]，而在热带狭温鱼类中表现为组成型表达，以适应长期的热应激环境[35]。在本研究中，正常条件下狭温热带鱼类虎皮鱼Hsp70基因在肝脏中具有较高的本底表达水平，而低温胁迫下脑、鳃、肝脏和肌肉组织PtHsp70基因表现为诱导型表达，表明狭温热带鱼类存在温度诱导型的Hsp70基因。

以往研究中未见在狭温性鱼类中发现诱导型热激蛋白基因的报道，一方面可能是因为狭温性鱼类的研究比较少，而且这些研究往往集中于极地低温鱼类中，而对狭温热带鱼类的研究非常匮乏；另一方面，组织样本或胁迫温度点比较少，如20～21 ℃低温胁迫下斑马鱼Hsp70基因mRNA转录本水平无明显变化[36-37]，而16 ℃低温胁迫下，斑马鱼热激蛋白Hsc70基因mRNA水平显著上调[38]；最后，HSP蛋白家族基因种类繁多，这些Hsp基因有些属于温度诱导型，有些是保守型，例如大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)17个Hsp70基因中仅2个能被低温诱导或抑制[39]。已报道的狭温鱼类Hsp基因仅是其中少数，所以暂时未发现温度诱导型Hsp基因。

虎皮鱼不同组织中PtHsp70基因表达水平均受到温度影响，在脑、鳃和肌肉组织中，PtHsp70基因mRNA水平随着温度降低而逐渐升高，表现为温度依赖性表达。因此认为，PtHsp70基因具有作为虎皮鱼响应低温胁迫分子标志物的潜能。

综上，本研究利用同源克隆和RACE克隆技术首次在虎皮鱼体内克隆到PtHsp70基因cDNA全序列，序列全长2317 bp，其中编码区长度1932 bp，编码643个氨基酸，与斑马鱼等鲤科鱼类的Hsp70基因cDNA序列高度相似。PtHsp70在虎皮鱼肝脏、肌肉、鳃和脑等不同组织中均有表达，其中在肝脏中的表达水平最高；PtHsp70基因在虎皮鱼不同组织中的表达水平均能被低温显著诱导，具有诱导型表达的特征。PtHsp70基因在虎皮鱼脑、肝脏和肌肉组织中，表现为明显的温度依赖性表达，因此具有作为虎皮鱼响应低温胁迫的分子标志物的潜能。本研究证明，狭温热带鱼类虎皮鱼的Hsp70基因具有组织特异性低温诱导型表达的特征。