甄晓然，沈 辉，万夕和,蒋 葛，范贤平，乔 毅，史文军，朱志杨，沙士兵，徐锦忠

( 1.上海海洋大学 水产与生命学院，上海 201306； 2.江苏省海洋水产研究所，江苏 南通 226007 )

近年来，随着对虾养殖产业迅猛发展，对虾疾病的发生也日益增多，严重制约了对虾产业的发展[1-2]。凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)急性肝胰腺坏死综合征是近年来我国发生较为严重的一种虾类疾病，该病主要是由副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)感染所引起，患病对虾出现空肠空胃、肝胰腺萎缩等症状，发病率和死亡率较高[3-5]。

生物拮抗是微生物群落内普遍存在的自然现象，利用动物病原菌的拮抗细菌制成有益微生物制剂，拮抗菌与病原菌相互抵制、相互排斥、相互制约[6]，对养殖水体中的病原微生物产生拮抗作用，抑制病原菌的生长，改善养殖环境，调节对虾体内的微生态平衡，具有生物安全和环境友好等优点，在对虾疾病生物防治领域中的应用越来越多[7]。

笔者自江苏南部沿海滩涂沉积物中分离到一株对多株凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死综合征病原弧菌具有明显拮抗效果的细菌，进行菌株的安全性试验，并对其分类学地位及扩培工艺进行研究，以期为凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死综合征的防控提供技术资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

14株病原菌分离自江苏如东患急性肝胰腺坏死综合征的凡纳滨对虾肝胰腺，鉴定为副溶血弧菌，经人工攻毒试验证实其具较强的感染力。

1.2 拮抗菌分离与筛选

1.2.1 分离

自江苏南部沿海滩涂沉积物采集泥样少许，分别用灭菌生理盐水进行梯度稀释，涂布于LB培养基、2216E培养基、高氏一号平板，28 ℃培养24～48 h，分离菌株保存备用。

1.2.2 初筛

取上述副溶血弧菌接种于2216E肉汤培养基，振荡培养配成1.5×107cfu/mL的菌悬液，滴入无菌2216 E平板，使平板表面展布少许菌悬液。挑取复苏24 h的待测菌点种于平板。每平板设3个平行，28 ℃培养48 h，观察点种区附近抑菌透明圈或覆盖圈的大小。

1.2.3 复筛

重复上述涂布步骤，将初筛效果较好的菌株采用滤纸片法测定拮抗效果，用灭菌镊子等距离放置4片无菌滤纸片于涂布好弧菌的平板，无菌生理盐水将拮抗菌发酵液调至3.0×108cfu/mL，向其中3片加入5 μL，另1片加入5 μL生理盐水作为空白对照，每个平板3 个平行。在28 ℃条件下培养24～48 h，观察有无覆盖现象和抑菌圈的出现，用游标卡尺测量覆盖圈或抑菌圈的直径。

1.3 菌株鉴定

1.3.1 菌株的形态观察及生理生化鉴定

参照文献[8-9]对菌株进行生理生化鉴定。结合分离菌在不同平板上的菌落形态、革兰氏染色和形态特点，进行细菌的初步鉴定。

1.3.2 16S rDNA序列比对及系统发育分析

采用天根生物专用试剂盒提取纯化细菌DNA，16S rDNA序列扩增采用细菌通用引物27 F: 5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，1492 R: 5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′进行扩增，产物经1%琼脂凝胶电泳，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。应用BLAST软件将所得序列与GenBank中的有关序列进行同源性分析，选取同源性高的序列，利用Mega 5.0进行多重比较后通过邻接法构建系统发育树。

1.4 菌株安全性试验

试验用凡纳滨对虾幼虾[平均体长(4.0±0.5) cm]取自如东某养殖场，幼虾在暂养7 d后随机分组。试验处理分浸浴组和投喂组。浸浴组：将待测菌株发酵后用生理盐水稀释密度为1×109、1×108、1×107cfu/mL，以0 cfu/mL为空白对照组，所有密度均设3个平行组，每组试验对虾30尾；投喂组：所筛选菌株与幼虾饲料混合，密度调至1×1010、1×109、1×108cfu/g，每个密度梯度设置3个平行组，同时设置空白组，空白对照组投喂生理盐水混合的饲料，各组试验对虾30尾。

试验进行 10 d，期间水温(20±1) ℃，盐度12.0，每日按照对虾质量的1%投喂饲料。保持充气，每日吸污，采用平均法记录10 d试验中幼虾的发病症状和死亡等状况。

1.5 菌株生长特性

研究3种培养条件(pH、温度、盐度)对拮抗菌H0011生长的影响，并绘制其生长曲线。

1.5.1 pH

将液体培养基pH分别调至3、4、5、6、7、8、9，共7组。按1%接种量将拮抗菌H0011接种于LB液体培养基中，每个pH设置3个平行，180 r/min振荡培养24 h。取菌悬液梯度稀释，涂布计数。

1.5.2 温度

将拮抗菌H0011接种于LB液体培养基中，分别于10、20、25、30、35、40、45 ℃，180 r/min培养 24 h，每个温度设置3个平行，取菌悬液梯度稀释，涂布计数。

1.5.3 盐度

配制0、10、20、30、40、50不同盐度梯度的LB液体培养基，分别接种拮抗菌H0011，每个盐度梯度设3个平行，180 r/min培养24 h后，分别取菌悬液梯度稀释，涂布计数。

1.5.4 菌株生长曲线

按1%接种量将拮抗菌H0011接种于LB液体培养基，180 r/min条件下摇床培养，每隔2 h取样，梯度稀释涂布计数，绘制时间与活菌数量的生长曲线。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌的分离筛选

在江苏沿海滩涂分离获得252株菌，用点种法初步筛选到6株对病原菌具有拮抗作用的菌株，分别为H0011、H0013、H0017、H0027、H0030、H0037。采用滤纸片法进行复筛，获得1株对14株对虾急性肝胰腺坏死综合征病原副溶血弧菌均有拮抗作用的菌株(H0011)。采用菌株H0011发酵液对14株携带毒力基因的副溶血弧菌进行抑菌效果分析，抗菌谱结果见表1。

表1 菌株H0011对14株致病性副溶血弧菌的抗菌效果

注：(1)“+++”代表极敏感，“++”代表高敏，“+”代表中敏.(2)抑菌圈(覆盖圈)直径> 20 mm为极敏感“+++”；15 mm<直径<20 mm为高敏“++”；10 mm<直径<15 mm为中敏“+”；直径<10 mm为低敏或无效“—”.

2.2 菌株鉴定

2.2.1 菌株的形态特征

菌株H0011在LB平板上24 h生长为直径1～3 mm的圆形、扁平菌落；菌落呈米粉色、边缘不整齐，湿润凸起、表面凹凸不平；短杆状，革兰氏阴性。

2.2.2 生理生化结果

菌株H0011生理生化试验见表2，根据以上结果，按细菌双歧索引鉴定步骤，该菌鉴定为居幼虫普罗威登斯菌(Providenciavermicola)，鉴定结果的可信度达81.5%。

表2 生化鉴定试验结果

注：“+”代表“阳性”，“-”代表“阴性”.

2.2.3 16S rDNA基因序列分析以及系统发育树的构建

采用细菌16S rDNA通用引物对菌株H0011的DNA进行PCR扩增，获得1443 bp序列。将该序列提交到GenBank，获得登录号为MH 922927，使用BLAST在线数据进行序列比对分析，结果显示菌株H0011与普罗威登斯菌KY 818989.1的亲缘关系最近，同源性达99%。选取普罗威登斯菌属及其他属与之同源性相近的11株细菌的16S rDNA序列，构建系统发育树(图1)。进化树的结果初步表明，分离获得的菌株H0011为普罗威登斯菌属，但未能鉴定到种。

图1 基于16S rDNA序列的菌株H0011系统发育树

2.3 安全性试验

通过高密度胁迫试验测试筛选普罗威登斯菌H0011的结果见表3。1×108、1×1010cfu/mL浸浴组的凡纳滨对虾，在整个试验过程中健康，摄食正常，活力良好，无空肠和死亡现象；1×109cfu/mL浸浴组的3组平行中有一组对虾出现 1 尾空肠现象。投喂组对虾在整个试验过程中健康，摄食正常，活力良好，无空肠和死亡现象。试验期间，浸浴组空白对照组对虾无死亡，但其中有一组出现1尾空肠现象。108cfu/mL密度以下的各组别之间均无显著差异(P>0.05)。

2.4 菌株的生长特性

2.4.1 温度对拮抗菌生长的影响

普罗威登斯菌H0011生长情况见图2，在10～45 ℃温度内均能生长。当温度为10～20 ℃时，生长速度较慢，生长差异较小；而当温度在20 ℃以后表现出了明显的生长优势，且30 ℃时生长速度最快。

表3 普罗威登斯菌H0011胁迫下的凡纳滨对虾试验结果

图2 不同温度下普罗威登斯菌H0011的生长情况

2.4.2 盐度对拮抗菌生长的影响

普罗威登斯菌H0011在不同盐度下的生长情况见图3。在盐度0～60内均能生长，其中最适生长盐度为10。在盐度0～10内，随着盐度的升高，普罗威登斯菌 H0011 菌落数逐渐增多，在盐度10的时候达到最大值；当盐度>10时，普罗威登斯菌 H0011的菌落数逐渐降低，但生长情况差异不显著。

图3 不同盐度下普罗威登斯菌H0011的生长情况

2.4.3 pH对拮抗菌生长的影响

普罗威登斯菌H0011在不同pH下的生长情况见图 4。在pH 4～10内均能生长，其中最适pH=8。在pH 4～8时，其生长速度呈上升趋势，在pH=8时菌落数达到最大值；当pH>8时，普罗威登斯菌H0011菌落数逐渐降低。

图4 不同pH下普罗威登斯菌H0011的生长情况

2.4.4 普罗威登斯菌H0011的生长曲线

普罗威登斯菌 H0011的生长曲线见图5。0～4 h 为迟缓期，4～20 h为生长对数期，菌体快速生长，20 h时菌体数量达最高值，此时菌体代谢活性高且生活力强。此后进入生长稳定期，直到76 h后由于培养基中营养缺乏及有害代谢产物积累，菌体代谢活性逐渐降低，发生衰老并自溶，菌体生长进入衰亡期。细菌发酵培养后密度可达到2.48×1010cfu/mL，且能长时间保持稳定，表明该拮抗菌普罗威登斯菌 H0011 具有良好的生长和活性保持能力。

图5 普罗威登斯菌 H0011的生长曲线

3 讨 论

3.1 拮抗菌在水产界的应用

生物间的拮抗关系普遍存在于自然界中，许多海洋细菌对水产养殖中的病原微生物可产生拮抗作用。以拮抗菌为主的微生物制剂可以减少抗生素的使用，抑制病原菌的生长，达到良好的生物防控效果[10]。海洋细菌作为益生菌的研究是当前一个热点，1966年，Burkholder等[11]发现了第一株有抑菌活性的海洋细菌，随后越来越多的病原菌拮抗细菌被筛选出。Tanasomwang等[12]自斑节对虾(Penaeusmonodon)幼体分离筛选出可产生胞外抑菌物质的海洋细菌，对鱼类、贝类的致病弧菌有良好的抑制作用。这些菌株作为益生菌被应用于水产养殖病原菌的防治中，均获得良好的抑制效果。

应用于水产疾病控制且常见的拮抗菌有乳酸杆菌(Lactobacillus)、芽孢杆菌(Bacillus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)和假单胞菌(Pseudomonas)等[13-16]，然而针对特定病原的拮抗菌研究相对较少，因此加强病原拮抗菌理论研究和应用开发有助于服务水产养殖业[17]。本研究从江苏南部滩涂泥样中筛选到一株对对虾急性肝胰坏死综合征弧菌有良好拮抗效果的菌株H0011，经16S rDNA鉴定为普罗威登斯菌，而生理生化鉴定为居幼虫普罗威登斯菌，但结果可信度为81.5%。由于16S rDNA鉴定可信度可达99%，因此本研究最后将该菌定为普罗威登斯菌，仅鉴定到属。普罗威登斯菌是肠杆菌科中常见的革兰氏阴性菌，常被用来作为农业生产中的有益细菌。

3.2 普罗威登斯菌的应用

对于普罗威登斯菌开发利用的有关研究报道较多。普罗威登斯菌可以用来作为植物害虫的抑制剂，周峰等[18]利用雷氏普罗威登斯菌(P.rettgeri)与营养物质尿素混合后制成 UN06颗粒剂，对番茄根结线虫(Meloidogyne)、黄瓜根结线虫、烟草根结线虫的防效达到90.17%、88.66%和85.98%。Surany[19]发现，在昆虫的幼虫到达蛹前阶段时，普罗威登斯菌可产生与昆虫自身的神经分泌调节系统相互作用的物质，抑制或干扰甲壳素的合成，使昆虫无法完成生命周期并在未成熟阶段死亡。普罗威登斯菌在环境保护上的应用也有报道。雷氏普罗威登斯菌可用于含氮有机废水的处理，有效去除水体中的有机氮、氨氮、亚硝氮及硝氮，并同时实现对有机碳的去除[20]。Mukherjee等[21]自受污染的地下水中分离出一种居幼虫普罗威登斯菌氏菌(KX926492)，对氟的最大去除率达82%。吴小毛等[22]发明了一种利用斯氏普罗威登斯菌(P.stuartii)修复核净污染的土壤和水体的方法，可解决农产品生产中部分农药残留超标问题及环境污染问题。

在水产养殖病害防控领域，陈偿等[23]用普罗威登斯菌22号制备了一种防控溶藻弧菌(V.alginolyticus)或副溶血弧菌微生物制剂，用于改善养殖水质，清除养殖系统中的溶藻弧菌或副溶血弧菌，预防养殖疾病的发生。曲凌云等[24]发现了一株雷氏普罗威登斯菌，其在与海水鱼类盾纤毛虫病原共同培养时，能在24 h内杀灭共培养体系中的盾纤毛虫，为防治海水鱼类盾纤毛虫病的防控提供了新方法。

普罗威登斯菌同时又是一种人类或者动物致病菌，可导致人类下呼吸道或尿路感染[25-27]。有研究发现，雷氏普罗威登斯菌可导致扬子鳄(Alligatorsinensis)发病及大量死亡[28]，中越边境猝死水牛体内也曾分离获得过拉氏普罗威登斯菌(P.rustigianii)[29]。说明普罗威登斯菌虽在一些方面对人类、动物界、环境等是有益菌，但同时也存在安全隐患。本研究结果表明，所分离获得的高效拮抗作用普罗威登斯菌H0011在108cfu/mL浸浴组和108cfu/mL投喂组试验处理过程中，组内对虾健康，活力良好，未发现死亡现象，该菌株在常规用量内对对虾是安全的。

3.3 本试验拮抗菌的优化及应用

一般认为，细菌产生抗菌物质的含量与其生长条件密切相关，如pH、培养温度等[30]，菌体的最适温度亦是其产生拮抗效果的最适温度，且pH与拮抗物质的产生也有很大关系，不同抗菌物质在不同pH中产生，其pH活性范围不同[31]。本研究优化了普罗威登斯菌H0011的生长条件，其最适温度为30 ℃，最适初始pH为8，最适生长盐度为10，说明其发酵条件温和，适合扩大培养，且适合对其做进一步深入的研究，这将为对虾急性肝胰腺坏死综合征的防控提供新的思路。

目前，我国凡纳滨对虾养殖生产中急性肝胰腺坏死综合征病情十分严峻，利用拮抗机理进行以菌抗菌防治有显著效果，未来应用前景可观。本试验针对凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死综合征所获得的益生菌普罗威登斯菌H0011，可以作为拮抗作用菌在对虾养殖生产中进行应用，在当前凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死综合征的防控应具有较好的应用价值。