褚国煜，李晓宇,2,4，王丽丽,2,4，李淑英，徐永平,,*

(1 大连理工大学生物工程学院，大连 116024；2 教育部动物性食品安全保障技术工程研究中心，大连 116600；3 大连赛姆生物工程技术公司, 大连 116620;4 辽宁省大连赛姆噬菌体应用工程技术研究中心，大连 116600)

1 引言

自1928年弗莱明发现青霉素以来[1]，抗生素给人类带来了巨大益处，但细菌的耐药性也不容忽视。细菌的耐药性是其固有的属性，抗生素的使用会加速细菌耐药性基因的传播[2,3]，细菌的耐药性由单一耐药性发展至多重耐药性。2017年2月底，世界卫生组织(WHO)公布了一份列有12种“超级细菌”的名单，并根据这些病原菌耐药性的强弱分为三个等级：极为重要、十分重要、中等重要。研发新型药物用以对抗超级细菌刻不容缓。

噬菌体自上世纪发现开始，就被前苏联和东欧国家的学者们应用于细菌感染的临床治疗[4]，但由于抗生素的使用而渐渐被人们遗忘。“后抗生素时代”即将到来，为寻求有效的药物对抗超级细菌，噬菌体治疗重新出现在人们的视线中。本文就利用噬菌体治疗耐药细菌细菌的机制进行阐述。

2 抗生素的滥用

抗生素的发现和大规模生产与使用是人类医学史上的巨大进步，挽救了数以亿计的生命。除用于临床治疗外，自上世纪50年代，美国食品与药品管理局(FDA)首次批准将抗生素添加在饲料中，随后抗生素被大规模应用与动物养殖业，在预防和治疗动物的传染性疾病、促进动物动物生长以及提高饲料转化率等发挥了重要的作用[5]。抗生素的大规模的使用让人们享受到抗生素带来的益处的同时，学者们也意识到了随之而来的细菌耐药性问题。我们即将进入“后抗生素时代”，即越来越多的细菌对抗生素产生耐药性，严重威胁了人类的生存和健康，全球将面临药品无效，好像回到了以前没有抗生素的时代。

3 多重耐药细菌

3.1细菌的耐药性的机理

细菌的耐药性一般分两类：一类是其固有的耐药性，不依赖于抗菌药物；它是细菌稳定的遗传特性，受自身染色体DNA控制；另一类是获得性耐药性，是指在选择压力存在的情况下经过基因突变或细菌在生长过程中由于移动耐药因子的转移而获得的一种表型。其中移动耐药因子包括质粒、转座子、整合子、噬菌体等。获得性耐药性主要包括移动因子和抗菌药压力作用下引起基因突变所导致的耐药性[6]，其作用机制如下图1[7]。

3.2 多重耐药细菌的感染现状

2017年2月，WHO公布了12种“超级细菌”的名单，将12种细菌根据耐药性的强弱细菌传播难易程度和需新型抗生素的迫切性等将它们分为极为重要、十分重要和中等重要三级。（1）3类极为重要：对碳青霉烯类抗生素耐药的细菌：鲍曼不动杆菌，铜绿假单胞菌，产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)肠杆菌科。（2）6类十分重要：万古霉素耐药屎肠球菌，甲氧西林耐药、万古霉素中介和耐药金黄色葡萄球菌，克拉霉素耐药幽门螺旋杆菌，氟喹诺酮类药物耐药弯曲菌属，氟喹诺酮类药物耐药沙门菌，头孢菌素耐药、氟喹诺酮类药物耐药淋病奈瑟菌。（3）3类中等重要：青霉素不敏感肺炎链球菌，氨苄西林耐药流感嗜血杆菌，氟喹诺酮类药物耐药志贺菌属。另一方面，美国感染病学会的抗生素效益评估小组经调查后认为屎肠球菌(Entcrococcus faccium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aurcus)，肺炎克需伯菌(Klcbsiclla pncumoniac)，鲍曼不动杆菌(Acinctobactcr baumannii)，铜绿假单胞菌(Pscudomonas acruginosa)及肠杆菌属(Entcrobactcr spccics)等6类细菌耐药情况极度严峻，取其各自拉丁文名称首字母而简称ESKAPE。

2015年WHO提供的数据显示，全球每年约有70万人死于“超级细菌”等耐药菌感染，到2050年，这一数字有可能突破千万，超过目前死于癌症的人数。近年来，一方面，没有新型的抗生素进入市场也没有有效的抗生素替代品的广泛使用，另一方面由于抗生素的滥用，药物的残留物以及耐药性微生物本身存在于水、土壤和空气中大大加速了细菌的耐药性产生。世界动物卫生组织(国际兽疫局)总干事Monique Eloit博士等发起呼吁：面对“超级细菌”需要立即行动。1996年，传染性疾病的权威及诺贝尔奖获得者Lederberg博士在PNAS的评论中指出：因耐药性细菌的出现，抗生素治疗不再像以前那样有效，应该重视噬菌体作为抗菌治疗生物制剂的研究[8]。

4 噬菌体治疗“超级细菌”感染

4.1 噬菌体治疗机理

图1 多重耐药菌的机制模型

噬菌体是一类能够感染细菌、真菌、放线菌等的微生物的总称。根据噬菌体对其宿主菌的作用方式的不同，可将噬菌体分为两类：温和噬菌体和烈性噬菌体。温和型噬菌体侵染细菌后，会将自身的遗传物质与宿主细胞的核染色体整合到一起，随着宿主细胞的遗传物质的复制而复制，噬菌体自身不会大量增殖，宿主细胞也不会被裂解。而烈性噬菌体在侵染其特异性的敏感菌株之后，会在宿主菌细胞内迅速并大量繁殖，从而裂解宿主细胞并从中释放、再侵染其他细胞。烈性噬菌体裂解宿主细胞一般分为五个步骤：吸附、穿入、增殖、装配、释放。根据烈性噬菌体的这一特性，学者们将其运用于治疗一些难以被抗生素治愈的细菌。

4.2 噬菌体治疗铜绿假单胞菌

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugonosa)，在医学上被称为绿脓杆菌，是院内感染的重要病原菌。中国卫生部国家细菌耐药性监测网(MOHNARIN)2017年12月发布的《2016年全国细菌耐药监测报告》(以下简称《监测报告》)中，对上报数据的1397所各级医院进行统计，铜绿假单胞菌有246242株，约占革兰阴性菌的12.7%，在革兰阴性菌耐药性中排名第三。在报告中指出的铜绿假单胞菌是对碳青霉烯类药物耐药是指对亚胺培南或美罗培南任一药物耐药。铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物的耐药率全国平均为22.3%，与2015年基本持平；不同地区铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物耐药率为9.8%～31.6%，其中辽宁省最高，为31.6%，湖南省最低，为9.8%[9]。

Watanabe等[10]，以小鼠为实验对象，应用分离到的噬菌体KPP10治疗由铜绿假单胞菌引起的小鼠肠源性败血病，有效率达66.7%。在此实验的基础上，McVay的小组[11]进行了针对性更强的实验。他们把分离到的3株铜绿假单胞菌噬菌体混合在一起，通过肌肉、皮下或腹腔注射的方式，来治疗由于烧伤而感染铜绿假单胞菌的小鼠，结果显示：这3种给药方式都能有效地提高小鼠的成活率(由6%上升到22%～87%)，其中腹腔注射效果最好(高达87%)，这在一定程度上推动了噬菌体的临床应用。Krylov等[12]评估了噬菌体疗法在根除耐药铜绿假单胞菌引起的儿童囊性纤维化(CF)的潜在应用，利用单一致病菌和噬菌体混合制剂。允许简单且快速地增强鸡尾酒的裂解谱，允许开发适合的能够规避与噬菌体抗性细菌突变体相关的策略。Furusawa等[13]评估了噬菌体分离株的宿主范围和它们裂解抗生素抗性铜绿假单胞菌的能力，目前的噬菌体可以裂解许多铜绿假单胞菌菌株(28/39)，包括对氟喹诺酮类具有高抗性的菌株(4/6)。总之，抗生素耐药细菌的噬菌体的应用是非常有效的。为了避免普遍的抗生素耐药细菌，需要进一步开发用于疾病治疗的噬菌体。Xu等[14]以医院临床上分离到的铜绿假单胞菌为宿主菌，从环境污水中分离纯化铜绿假单胞菌噬菌体D204，当感染复数为0.1和1时，对宿主菌生长有抑制作用，在180min后可完全抑制宿主菌生长。铜绿假单胞菌噬菌体D204具有较强的裂解宿主的能力，其对酸碱和热比较稳定，裂解宿主时潜伏期较短，可以作为铜绿假单胞菌的储备噬菌体。Didamony等[15]在埃及的污水样品中分离出两个命名为φPSZ1和φPSZ2的噬菌体，感染多重耐药铜绿假单胞菌。两种噬菌体都能够感染13种不同的铜绿假单胞菌菌株，并且对其它测试的细菌没有影响。这些结果表明两种噬菌体具有用于控制铜绿假单胞菌的高潜力的噬菌体应用。

4.3 噬菌体治疗鲍曼不动杆菌

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii AB)是一种革兰阴性致病菌细菌，中国卫生部国家细菌耐药性监测网(MOHNARIN)2017年12月发布的《监测报告》中，鲍曼不动杆菌共208689株，占革兰阴性菌的10.8%，排名第四。与铜绿假单胞菌相似，鲍曼不动杆菌也是对碳青霉烯类药物特别是亚胺培南或美罗培南任一药物耐药。鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物的耐药率全国平均为60.0%，较2015年上升了1%；不同地区鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药率范围是24.8%～81.2%，其中河南省最高，为81.2%，天津市最低，为24.8%[9]。

传统噬菌体治疗的给药方式主要为口服和皮下注射两种，而以注射的给药方式还处于动物实验阶段。2017年，美国历史上首例通过静脉注射“鸡尾酒”噬菌体治疗多重耐药鲍曼不动杆菌感染患者，在经过200多天的治疗痊愈出院。由于采取多种抗生素乃至粘菌素等药物对患者体内感染的细菌都未见效果，FDA特批噬菌体作为紧急研究新药(emergency investigational new drug eIND)以用于治疗该患者。Robert等[16]筛选出九种对患者体内感染的鲍曼不动杆菌具有活性的噬菌体，美国生物防御研究局(Biological Defense Research Directorate BDRD)以及海军医学研究中心(Naval Medical Research Center NMRC)两个研究中心从环境中筛选出200余种的噬菌体为原料，并从中筛选出98种对患者体内噬菌体有吞噬效果的噬菌体，后将这98种噬菌体进行再次的分离鉴定，几种噬菌体混合使用效果明显优于单独使用，因此制备为多种不同的“鸡尾酒”噬菌体试剂，分别命名为I、II、III、IV。前3个月的临床过程中不可避免地出现下坡症状，在开始静脉内噬菌体治疗的48h内观察到了明显的变化。在通过静脉内注射施用5×109PFU噬菌体之前和之后5min收集的血浆样品表明全身循环中的噬菌体滴度从0PFU/ mL迅速增加至1.8×104PFU/mL。 噬菌体效价下降30min为4.4×103PFU/mL，60min下降3.3×102PFU/mL，注射后120min下降20 PFU/mL。采取注射的初期，体内的产生了噬菌体抗性，而在注射后期通过对患者体内生理指标的检测，发现噬菌体能够改善鲍曼不动杆菌对米诺环素等抗生素的敏感性，也有文章证实噬菌体与抗生素之间存在某种协同作用，于是联合施用噬菌体与抗生素，在胆囊腔和第三腹腔进行注射，通过长期的治疗，病人得到痊愈并开始了正常的生活。

5 展望与发展

在抗生素泛滥的时代人们无可避免的要面对细菌产生的抗生素耐药性问题，广泛的使用抗生素无疑加剧了多重耐药菌，乃至超级细菌的产生。面对这些问题，寻求新的有效药物已经成为当务之急，噬菌体是一种绿色、高效的治疗方法，因其来源广泛、宿主专一性高等为人们治疗“超级细菌”提供了新思路。细菌耐药性的发展速度远比人们开发新型抗生素的速度要快得多，单纯的使用抗生素治疗并不是长远之计，噬菌体治疗为人类以及动植物的细菌创伤性感染开启了新的纪元。