丛聪，袁玉玉，王丽丽,2,4，李晓宇,2,4，李淑英，徐永平,,*

(1 大连理工大学生物工程学院, 辽宁大连 116024;2 动物性食品安全保障技术教育部工程研究中心, 辽宁大连 116600;3 大连赛姆生物工程技术公司, 辽宁大连 116620;4 辽宁省大连赛姆噬菌体应用工程技术研究中心，辽宁大连 116600)

1 前言

近几年来，每每发生由食源性病原菌引起的各种疾病，尤其是食物中毒和肠道传染病。由于全球性食品贸易的快速增长，导致了饮食习惯、食品加工方式的变化，食源性致病菌不断出现以及细菌耐药等一系列问题，这些均成为人类必须面对的严峻挑战[1]。食品安全问题备受关注，由于食品生产技术中不可能完全杀灭食物中的病原菌，因此国内外一直在研究并完善杀灭食源性致病菌的话题[2]。人们逐渐开始接受将噬菌体(Bacteriophage，简称phage)应用于食品工业中控制食源性致病菌，这不仅能保障食品的安全性、延长食品保质期，同时也促进了人们对噬菌体自身安全性领域的研究。

通常在食品生产中用于控制食源性致病菌的方法包括物理(蒸汽、干热和紫外线照射)和化学(杀菌剂、防腐剂)两种处理方法，采用这两种方法处理的食品感官品质会受到影响，且因不属于绿色食品而使消费者产生排斥心理[3]。热杀灭技术属于传统的物理杀菌方法，但因加热温度过高，食品的色泽、风味会发生明显变化，营养价值也大幅降低；冷杀菌技术在包装打开以后，又有再次染菌而腐败的可能[4]。另外，某些抑制食源性致病菌的手段不能直接应用于新鲜水果蔬菜和即食食品中。目前常见的食源性致病菌包括沙门菌(Salmonella)、大肠埃希菌(Escherichia coli) O157:H7、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和弯曲杆菌(Campylobacter)等。

因此人们开始使用噬菌体作为食品中的天然抗菌剂来杀灭或抑制食源性致病菌，从而保证食品安全[5-7]。本文旨在探讨噬菌体安全性的问题、运用噬菌体控制食品中致病菌的理论依据，以及对致病菌进行控制的研究现状。

2 噬菌体概述

噬菌体是一种能够感染细菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒。它不具有感染哺乳动物细胞的能力，仅能特异性地侵染其宿主菌。因其具有严格的宿主特异性特点，一种噬菌体往往只能感染和裂解某种细菌，甚至只裂解种内的某些菌株[5]。噬菌体只寄居在易感的细胞宿主内，它可以在脱离寄主细胞的状态下维持一段时间的活性，若一旦脱离了宿主细胞，既不能生长也不能复制[8]。噬菌体主要有两种类型——裂解性噬菌体(virulent phage)和溶原性噬菌体(温和噬菌体，temperate phage)。溶原性噬菌体一般不引起宿主菌的裂解[9]，而应用于食品工业的噬菌体是裂解性噬菌体，它在侵染宿主菌后会引起宿主菌裂解，同时释放子代噬菌体，进而达到杀菌作用。

大量研究和应用实例已经表明，利用噬菌体对食品中的致病菌进行控制是一个可行、高效，且有着广阔发展空间的方法[10]。噬菌体作为细菌的天敌被用于食品上时，由于其高度特异性而只会杀灭目标宿主菌，不会对食品的固有菌群产生影晌，这正是食品抗菌剂所需要的品质，它有助于维持食品特别是发酵食品的产品品质[11]。因此，从环境中筛选出能特异性侵染食物中病原菌的噬菌体，并利用它们对食品中的致病菌进行控制，这对改善食品的品质、提高食品安全性等方面具有重大意义。

3 噬菌体在食品工业中的应用

存在于食品原辅料采集、生产、加工、储藏等环节的食源性致病菌会引发食品污染，造成食品腐败变质并传播疾病，噬菌体可以通过杀灭食源性致病菌来保证食品安全。

3.1 原料采集时杀灭病原菌

宰杀动物时，有害细菌会随血液、粪便污染尸体，因而可在屠宰后用噬菌体对动物尸体进行消毒；也可在原料采集(挤奶或屠宰)前，通过给动物口服噬菌体的方法杀灭其体内病原菌。例如，Bach等[12]发现在人工瘤胃中的噬菌体DC22可有效清除E.coliO157:H7，而得了疯羔病的羊口服噬菌体制剂后却不能减少其粪便中细菌的含量，这可能是因为没有足够的噬菌体到达羊肠道所导致。Raya等[13]给羊口服噬菌体CEV1来杀灭E. coliO157:H7，服用2 d后羊肠内的E. coliO157:H7的数量明显降低。

3.2 生产及加工环节的消毒

噬菌体可对生产环境(工作表面、地面、墙壁、加工设备等)进行净化和消毒。例如，布卢维尔等[14]用噬菌体混合物处理被阪崎肠杆菌(Enterobacter Sakazakii)污染的不锈钢盘表面后，没有再发现该菌，而未被处理的对照组仍有该菌存活甚至可以轻微生长。Viazis等[15]用噬菌体混合物BEC8处理3种不同材质工作表面上的E. coliO157:H7，室温1 h后噬菌体能起到有效的杀菌效果。

在食品生产中可直接将噬菌体与食物混合使用。O'Flynn等[16]用3种不同噬菌体来处理被103CFU/gE. coliO157:H7污染的牛肉，在37 ℃储存时，78 %的牛肉未发现有大肠埃希菌，而剩余的22 %的牛肉中大肠埃希菌的数量都低于10 CFU/g。Goode等[17]发现将噬菌体应用在食品中可以减少95 %的空肠弯曲杆菌，同时还发现了能够杀灭和抑制沙门菌的噬菌体，并且即使是沙门菌的抗性菌株在高浓度的噬菌体作用下也会被杀灭，两个或两个以上的噬菌体可直接杀死被侵染的宿主菌。Higgins等[18]成功用噬菌体杀灭了禽肉产品上的肠炎沙门菌，Humberto等[19]对鸡肉表面也做过类似的实验。

3.3 原料消毒并延长食品储藏期

噬菌体作为天然的抗菌剂和防腐剂可直接对新鲜的水果蔬菜进行消毒。例如沙门菌是引起人类食物中毒的主要致病菌之一，在实验中用噬菌体混合物对已感染沙门菌的哈密瓜和苹果进行噬菌体处理后，哈密瓜上的沙门菌明显减少；然而，苹果片上的沙门菌似乎未受噬菌体影响，可能由于苹果片上的pH较低导致噬菌体数量快速减少造成的[20]。

噬菌体还能延长食品的保质期，例如阪崎肠杆菌能引起新生儿脑膜炎，主要通过婴儿配方奶粉进行感染。由于目前生产奶粉时不能做到完全无菌，所以当奶粉在室温存放没有被及时食用时，少量致病菌大量繁殖，最终会对婴幼儿健康构成潜在危险。为了可以安全储存婴儿配方奶粉，雀巢技术公司分离出了对阪崎肠杆菌具有强裂解力的无毒噬菌体ESP 732-1，用以防止阪崎肠杆菌污染，这种T4噬菌体能在24 ℃～37 ℃有效抑制该菌的生长，其浓度与抑菌效果成正比，当浓度达到109PFU/mL时能够完全杀灭阪崎肠杆菌[14]。Whichard等[21]用宿主谱广的沙门菌噬菌体Felix-O1对香肠中的鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)进行侵染，结果发现鼠伤寒沙门菌的数量明显减少。另有研究发现，在干酪生产的发酵液中人为地加入沙门菌及其噬菌体SJ2，储存数月后，沙门菌依然不能生长[22]。

3.4 检测食源性致病菌

噬菌体的宿主特异性在食品工业中可用于检测食源性致病菌，如噬菌体扩增法检测技术：在待检测食品中加入某种噬菌体，若其宿主菌存在于食品内则会被噬菌体迅速侵染，随后用特异性高的杀病毒剂清除所有未侵染的噬菌体，已侵染的噬菌体则继续扩增，进而裂解细胞，释放子代噬菌体继续侵染周边宿主细胞，最终在培养皿中展现出噬菌斑，此种方法可证明食品中存在食源性致病菌。其他检测食源性致病菌的方法还有荧光染料标记法、检测报告基因法等[23]。

4 已开发的食品级噬菌体制剂产品

在国外，很多生物技术公司对噬菌体的研发非常重视，目前已有多家公司参与研制并生产噬菌体成品制剂，部分公司信息详见表1。噬菌体在食品上用来对食源性致病菌进行生物防控的研究取得了很大进展，市场上已有一些噬菌体的产品被商业使用，并已通过美国食品药品管理局(Food and Drug Administration, FDA)认证后上市，有9种已通过GRAS (Generally Regarded As Safe，公认安全)认证级别，还有2种待批准为GRAS产品。

2006年，FDA批准李斯特菌噬菌体制剂Listex™P100在即食食品和禽类产品中使用，它由荷兰EBI食品安全公司(EBI Food Safety)研发，可有效避免肉类及奶酪类产品中李斯特菌的污染，并且对人体无害，这是世界上第一个通过FDA认证的用于食品工业的产品[24]。这个产品标志着FDA首次将噬菌体视为了GRAS级添加剂，随后获得了欧洲、澳大利亚和新西兰的批准应用于食品中[25]，之后不断有针对不同致病菌的噬菌体产品通过FDA GRAS的认证并获得应用批准，所有GRAS级噬菌体制剂详见表2，部分抑制食源性致病菌的噬菌体研究详见表3。

在食品工业中，噬菌体自身的抗微生物性质可减少人们对抗生素的依赖和利用，并能显著降低制药公司开发新药的数量，降低开发总成本，更容易满足消费者对不含病原体和合成化学品食物的需求。另外，由OmniLytics公司生产的噬菌体制剂Agriphage™是第一个由美国环保署(US EPA)正式批准用于农业的噬菌体产品，主要用来治疗农作物的番茄细菌斑病[51]。

5 噬菌体的特征

5.1 宿主特异性

噬菌体的宿主特异性可以保证其在裂解宿主菌的同时不杀死食品生产中的发酵菌株，因此在使用噬菌体对生产设备等进行消毒时，不用担心噬菌体会影响发酵生产。此外，噬菌体仅能侵染并裂解细菌细胞，而不会侵入或杀死哺乳动物的细胞，因此对人体无害。

5.2 增殖能力强

一个适当条件的裂解周期内，每个噬菌体可产生约200个子代噬菌体，这表明它可以以200n的速度进行增殖。经过不断地复制和增殖，进而裂解大量的宿主细胞，因此可快速地抑制并杀灭食源性致病菌。

表1 部分噬菌体制剂研发公司

表2 所有FDA批准的GRAS级噬菌体制剂

表3 部分食品级研究所用噬菌体

5.3 安全无毒副作用

5.3.1 自然界中广泛存在

自然环境中含有高丰度的噬菌体，数量大、种类多。干净的水中噬菌体含量为109PFU/mL，表层海水含量为107PFU/mL，陆生系统也含有大量的噬菌体[52]。同样地，食物中也有大量的噬菌体。研究人员从泡菜中分离出了26种不同的噬菌体[53]。每克新鲜的肉类、果蔬以及熟食中含有104个E. coli噬菌体[54]。很明显，我们每天通过饮食、饮水甚至呼吸都会摄入大量的噬菌体。

5.3.2 对肠道菌群无害

噬菌体仅专一性地寻找对应的宿主菌，而对肠道内其他的细菌无害，因此不会干扰体内正常的菌群及代谢，并且生物机体自身也能通过免疫系统清除体内的噬菌体。研究人员用E. coli噬菌体做了安全性研究，给小鼠及人类志愿者直接喂食大剂量的E. coli噬菌体，这些噬菌体能够在体外感染E. coli菌株，结果显示该噬菌体无论对小鼠还是人类的机体都没有明显影响[55,56]，且对消化道内的微生物菌群也没有影响，可能是由于E. coli菌群生活在噬菌体不容易到达的位置，也可能是机体的免疫系统清除了体内的噬菌体，使之减少到不能杀灭细菌的水平[57]。

噬菌体本身是由核酸和蛋白质构成，其成分对人体不具有毒害作用，而且也不会改变食物的颜色、结构和味道[58]。活性噬菌体被机体摄入后通过消化分解，产生出核酸和蛋白质，若再进一步可分解为磷酸、碱基、氨基酸等，均是无毒的代谢产物。因此，有活性的噬菌体仅侵染宿主菌，失去活性的噬菌体也不会对机体产生任何毒害作用。

5.3.3 有长期使用的历史

自从1919年Felix d'Herelle第一次采用噬菌体完成了对痢疾的治疗后，东欧和前苏联就一直研究和生产用于治疗疾病的噬菌体制剂[59]。噬菌体的给药途径大部分是口服和表面擦药，也有肌肉注射、静脉注射甚至是颈动脉注射[60]，但并没有关于噬菌体对机体产生不良影响的报道。

García等[61]以金黄色葡萄球菌的温和噬菌体ΦH5和ΦA72为试验材料，通过DNA随机缺失法得到与两株温和噬菌体ΦH5和ΦA72相对应的烈性噬菌体，并将这两株烈性噬菌体用于干酪的制作中，有效地抑制了干酪中的金黄色葡萄球菌。Edita等[62]用两种噬菌体混合物来灭活新鲜和硬型奶酪中的金黄色葡萄球菌，结果发现噬菌体的加入使宿主菌显著减少，并且没有影响发酵剂菌群结构，同时也维持了奶酪预期的物理化学特性。Pasternack和Sulakvelidze[63]申请了6个单增李斯特菌噬菌体的专利，这些噬菌体能够有效控制由单增李斯特菌引起的食物污染。美国Omnilytics公司销售的噬菌体混合制剂用在温室和田间已有10多年的历史，已证明该产品对细菌斑点感染病的治疗是安全及有效的，已被美国EPA批准使用。在欧洲，EBI食品安全委员会授权认同芬兰一家公司生产的噬菌体产品LISTEX™是安全的[64]。

所以通过以上的证据我们可以得知，吃到以噬菌体作为食品添加剂的食物是不需要担惊受怕的，因为噬菌体是“可以被吃的”。

6 噬菌体对食源性致病菌的裂解机制

已有文献报道过噬菌体侵染及裂解宿主菌的机制，使用噬菌体控制目标菌主要有两种方式：

(1)直接用分离出的噬菌体控制目标菌，如Carlton等[24]研究了单增李斯特菌的噬菌体P100，全基因组测序后给小鼠服用大剂量的噬菌体P100，口服独立性试验验证应用噬菌体P100是安全可靠的，小鼠没有表现出副作用；同时，他发现用噬菌体P100能够完全清除软干酪中的李斯特菌属，并且在食物中P100和A511都能杀灭李斯特菌，因此他认为该噬菌体可以安全有效地抑制李斯特菌[24]。Guenther等[65]报道单增李斯特菌的噬菌体A511在肉制品和乳制品中对单增李斯特菌有一定的控制作用。Abuladze等[40]将三种噬菌体的混合物作用于污染了大肠埃希菌O157:H7的食品中，结果发现噬菌体能够显著降低食品中大肠埃希菌O157:H7的量。Modi等[22]发现在制作Cheddar干酪之前向原料奶中添加噬菌体SJ2能有效抑制沙门菌属，在干酪99 d的储存期内能使沙门菌浓度保持在50 CFU/g以下，而不加噬菌体SJ2的干酪在99 d的储存期内沙门菌的浓度为103 CFU/g。Carvalho等[66]成功分离出了43株噬菌体，它们能有效抑制结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)和空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)，从而为保障食品安全提供可能。Bigwood等[43]将噬菌体Cj6接种于污染了空肠弯曲菌的牛肉中，结果显示空肠弯曲菌的数量有一定程度的减少，同时他将沙门菌噬菌体P7接种于污染了沙门菌的牛肉中，结果发现沙门菌数量显著降低，当噬菌体的侵染数量越多，沙门菌的减少量越多。

(2)在分离得到目标菌的噬菌体后，通过分子生物学手段获得噬菌体的裂解酶，利用裂解酶来控制目标菌的效果尤为显著。已发现噬菌体K能够抑制葡萄球菌的活性，其内溶素Lys K已被克隆并用乳酸乳球菌表达。人们发现Lys K可以杀死9种葡萄球菌，其中包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)[67]。Donovan等[68]将金黄色葡萄球菌噬菌体phi11应用于牛奶中，其裂解酶对金黄色葡萄球菌和其他6种凝固酶阴性的葡萄球菌均有裂解作用，这说明该酶可直接用于牛奶中控制致病菌。Celia等[69]将产溶菌素的基因重组到质粒上后转入到大肠埃希菌中表达，纯化出溶菌素Ply700后对其性质进行了测定，Ply700对有乳链球菌(Streptococcus uberis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)和停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)均能裂解。Obeso等[70]用大肠埃希菌表达并纯化了金黄色葡萄球菌噬菌体ΦH5的裂解酶LysH5，将其用于巴氏消毒奶中，结果表明未在样品中检测到金黄色葡萄球菌。Loessner等[71]将单增李斯特菌噬菌体A118编码的噬菌体内溶素Ply118用于提取DNA、RNA和破碎单增李斯特菌的细胞壁上；乳酸乳球菌中的乳球菌素启动子启动并表达出克隆的Ply118和Ply511，它们可以有效抑制单增李斯特菌的活性。Hu等[72]对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)噬菌体PaP3的裂解酶进行了鉴定分析，结果表明噬菌体PaP3的裂解酶对金黄色葡萄球菌具有显著的抑制作用，但对铜绿假单胞菌和大肠埃希菌无抑制作用。

7 噬菌体的潜在风险

以噬菌体为基础的生物防控手段在提高食品微生物安全方面的应用具有很大的潜力，因为它们安全使用的历史悠久、操作处理相对简单，并且其抗菌活性具有高度特异性。噬菌体的安全使用主要体现在：噬菌体在自然界中无处不在，能在动物和人体中自然共生，包括在食品生态系统(Food Ecosystems)中也是，而且在东欧地区临床上已被广泛应用。噬菌体的高特异性表现在：对哺乳动物细胞无害，对肠道菌群没有不利的影响，是其它高效抗菌剂的来源。但不可否认的是，任何事物都有其弊端，噬菌体也具有相应的潜在风险。

7.1 噬菌体的溶原现象

不是所有的噬菌体都适于杀灭细菌病原体。溶原性噬菌体不会杀死宿主菌，而是将其基因组整合到宿主染色体上(溶原现象)，并能使宿主菌抵抗其它噬菌体的溶菌作用[9]；另外，整合的基因组可以改变宿主的表型，甚至能够增强宿主菌的致病性或毒力。例如霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的霍乱毒素CTX是由整合的噬菌体CTX的ctxA和ctxB两个基因所编码的[73]；又如由E. coli的志贺样毒素是由其整合基因组中的溶原性噬菌体基因stx1和stx2编码的[74]。

7.2 噬菌体的转导作用

转导是以噬菌体为媒介，把供体菌的小片段DNA携带到受体菌中，经过交换及整合使受体菌获得供体菌的部分遗传性状的现象，这个过程很有可能会把新的基因传递给受体菌[75]。如果噬菌体在致病菌(供体菌)中增殖后携带了致病基因，则很有可能把受体菌也转变成有致病性的致病菌[76]。因此，若不得已使用致病性宿主来增殖噬菌体，则应选用不具有转导作用的噬菌体。研究发现，在李斯特菌和梭状芽孢杆菌(Clostridium Prazmowski)的噬菌体中，有明确固定基因组末端的噬菌体是不具有转导作用的，而含有末端冗余并有环状排列基因次序的噬菌体是能够进行转导作用的[77,78]。

7.3 出现抗噬菌体菌株

细菌可自发突变产生抗噬菌体的菌株(抗性菌)。例如Park等[79]研究变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)时发现了抗噬菌体的菌株。大部分细菌的突变率为10−6，一般不会产生大量的抗噬菌体菌株，因此对噬菌体的杀菌效果不会产生明显影响。但若长期多次使用该噬菌体，在自然选择的影响下，只有抗性菌菌株能够存活下来并不断增殖，这时该种噬菌体就很难对抗性菌进行杀灭，只能寻找方法与细菌共进化产生能杀灭抗性菌的噬菌体。

8 总结

人们最早用噬菌体来治疗细菌性疾病，后来逐渐将其应用在食品工业上，目前已筛选出可用来抑制阪崎肠杆菌、E. coliO157:H7、伤寒沙门菌等食源性致病菌的噬菌体。噬菌体制剂Listex™ P100是世界上第一个通过FDA的GRAS级认证产品，并被批准作为食品生产中的加工助剂使用。利用噬菌体对食品中的致病菌进行控制是一种高效、快速、发展前景广的生物防控手段，在研究和应用领域中均值得进一步地探索。噬菌体的裂解谱较窄使其应用受到了限制，因此我们需要筛选出更多的广谱噬菌体。另外，噬菌体应用的安全性也将是以后持续关注的重点。针对目前国内外频发的由食源性致病菌引起的食品安全问题，特异性噬菌体的研究与开发势必成为未来的趋势和热点，这些都预示着噬菌体在食品安全中的应用前景非常广阔。

但我们还应留意噬菌体的溶原现象和转导作用等的潜在风险，它们会改变宿主菌的表型，具有增强宿主菌的致病性或毒力的可能。因此我们在研究及使用噬菌体时，应避免使用溶原性噬菌体和具有转导作用的噬菌体。

对于某些食品，噬菌体不能对病原菌起到完全地杀灭或抑制作用[20]，另外细菌若自发突变可能会出现抗噬菌体菌株。因此若能将噬菌体制剂与其它保鲜防腐方法结合使用则可更有效地抑制病原菌，从而保障食品的安全性和稳定性。