梁 荣,樊 琛,李 燕,曾庆华,刘 冉,郭兴峰

(聊城大学农学院,山东聊城 252000)

阿胶(Collacoriiasini)为马科动物驴(EquusasinusL.)的干皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶,与人参、鹿茸并称为滋补三宝,始载于《神农本草经》[1]。阿胶含明胶、蛋白质、微量元素等多种有效成分,具有抗疲劳、抗氧化、增强免疫、促进造血功能等多种功效[2-5]。

目前,通常采用直接加入阿胶原粉的方式制成阿胶制剂,如口服液、泡腾片、软胶囊等[6-7]。阿胶蛋白需要经蛋白酶降解为小分子肽后才能被吸收,但对于脾胃虚弱、消化能力低下的人群,直接服用阿胶或其制剂不但给胃肠带来较大负担,而且阿胶的功效也得不到充分发挥[8]。因此,通过可控酶解技术将阿胶水解成小分子肽,能够有效增强阿胶的生物利用度[9-10]。近代科研工作者运用现代化技术手段,对阿胶化学成分、功效物质、药理作用及质量标准等进行了多方面的探讨和研究,并取得了显著的研究成果[11-14]。然而,长期以来受到技术条件和传统思想的限制,阿胶的很多功效还未得到足够的现代科学理论和实验的证实。特别是在调节机体免疫功能方面,虽然已经有相关的实验研究报道,但是研究内容不够充分[15-16]。黄宏轶等[17]研究发现参苓阿胶复方膏对气虚体质小鼠免疫调节能力具有改善作用;李志等[18]研究发现阿胶口服液能提高小鼠的细胞免疫和体液免疫功能。关于阿胶免疫调节的研究多集中在一些阿胶制剂的生理活性方面,并且这些研究对阿胶免疫调节机制的研究并不深入。

因此,本研究以小分子阿胶肽(LMWPC)为实验对象,通过研究LMWPC对小鼠体液免疫及细胞免疫两方面的影响,深入探讨和解析LMWPC对机体免疫功能的调节机制,为阿胶新型制剂及保健品的研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小分子阿胶肽(LMWPC,MW<1000 Da) 东阿阿胶股份有限公司;SPF级健康ICR雌性小鼠,体重18～22 g 实验动物合格证号SCXK(京)2012-0001,北京维通利华实验动物技术有限公司;动物饲料(许可证号:SCXK(京)2014-0008) 北京华阜康生物科技股份有限公司;Yac-1细胞 山东省医学科学院;INT、PMS、NAD、Giemsa染液 美国Sigma公司;0.2 mol/L Tris-HCl缓冲液、Hanks液、SA缓冲液、PBS缓冲液、1% NP40、RPMI1640培养液 美国Gibco公司;YAC-l细胞、绵羊红细胞(SRBC)、补体(豚鼠血清)、ConA、小牛血清、都氏试剂 杭州四季青生物材料有限公司;其他试剂 均为分析纯。

上海晟声K1301 K1302半自动凯氏定氮仪 上海双旭电子有限公司;Waters 1515 GPC凝胶色谱仪 美国Waters公司;SPECTRAMAX plus 酶标仪 美国MD公司;PL203 型电子天平 瑞士METTLER TOLEDO公司;Thermo 3111 CO2培养箱 美国Thermo公司;SW振荡水浴槽 优莱博技术(北京)有限公司;Sorvall ST8R高速冷冻离心机 美国Thermo公司;BDS-300倒置生物显微镜 重庆奥特光学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白质含量的测定 采用凯氏定氮法测定LMWPC中的蛋白质含量[19]。样品消解:用电子天平分别称取0.1 g硫酸铜、3 g硫酸钾、0.3 g粉末样品、10 mL硫酸加入定氮管中,放入消解炉逐渐升温至400 ℃待内容物全部炭化,泡沫全部停止后,液体变成澄清透明蓝绿色后继续加热30 min,停止加热,冷却取出。定氮蒸馏:用半自动凯氏定氮仪进行定氮蒸馏,经计算确定蒸馏参数,稀释水量为10 mL、硼酸体积为10 mL、加碱体积为30 mL、蒸馏时间为210 s、淋洗水量为8 mL。盐酸滴定:选用浓度为0.1 mol/L盐酸对吸收氨气后的硼酸溶液进行滴定,利用滴定管记录滴定体积。

蛋白质含量(g/100 g)=(V1-V2)×C×0.0140×6.25×100/(M×10/100)

式中:V1是滴定时消耗盐酸的量(mL);V2是空白实验所消耗的盐酸量(mL);C是盐酸标准液浓度(mol/L);M是样品质量(g);6.25为氮换算为蛋白质的平均系数。

1.2.2 分子量分布的测定 应用高效凝胶色谱法对LMWPC的分子量(MW)分布进行测定[20]。色谱柱:TSKgel 2000 SWXL;流动相:乙腈∶水∶三氟乙酸=45∶55∶0.1 (v/v);流速:0.5 mL/min;柱温30 ℃;进样量:10 μL,分别以乙胺酸-乙胺酸-乙胺酸(MW=189)、乙胺酸-乙胺酸-酪氨酸-精氨酸(MW=451)、杆菌酶(MW=1450)、抑肽酶(MW=6500)、细胞色素C(MW=12500)5种样品为标准品。

1.2.3 实验动物分组与给药 小鼠在温度20～22 ℃,相对湿度45%～65%环境中饲养,适应饲养7 d,适应期内小鼠自由摄食和取水,适应期结束后按体重采用随机区组设计分组法分为五组,即对照组、免疫一组(血清溶血素测定)、免疫二组(进行抗体生成细胞检测)、免疫三组(迟发型变态反应实验)和免疫四组(小鼠脾淋巴细胞转化实验)。阿胶人体推荐量为每天2.1 g/60 kg·bw[21],实验设计低、中、高三个剂量组,即0.18、0.35、1.05 g/kg·bw,三组剂量分别相当于人体推荐摄入量的5倍、10倍、30倍(每小组均为6只小鼠)[22]。以蒸馏水为溶剂将样品分别配至所需浓度,同时设立蒸馏水溶剂对照组,按每天0.2 mL/10 g·bw连续经口灌胃30 d 后,测各项免疫指标。

1.2.4 血清溶血素测定 实验结束前5 d,小鼠腹腔注射绵羊红细胞(SRBC),摘眼球取血,离心取血清稀释100倍,进行半数溶血值(HC50)测定。实验组加入稀释后的血清100 μL,对照孔加入100 μL SA 缓冲液(5倍稀释),而后依次加入 50 μL 10% SRBC和100 μL补体。37 ℃恒温水浴锅中反应30 min后,离心 5 min(1500 r/min)取上清液50 μL,加入150 μL都氏试剂,半数溶血孔设置为12.5 μL 10%(v/v)SRBC,加入200 μL都氏试剂。采用微量振荡器混合均匀,静置 10 min 后,应用酶标仪测定540 nm波长处的光密度值[23]并依据如下公式计算其HC50。

HC50=样品光密度值/SRBC半数溶血光密度值×稀释倍数

1.2.5 抗体生成细胞检测 根据Jerne改良玻片法检测抗体生成细胞[24]。SRBC免疫后的小鼠颈椎脱臼处死,取出脾脏制备脾细胞悬液。将表层培养基加热溶解后,50 ℃水浴保温,与等量pH7.2～7.4的2倍浓度Hank’s液混合,并分装于小试管(每管0.5 mL)。向管内加入50 μL 10% SRBC,20 μL 脾细胞悬液(5×106个/mL)迅速混匀,而后倾倒于玻片上做平行片。待琼脂凝固后,将玻片水平扣放在片架上,放入CO2培养箱温育1.5 h,加补体后继续温育1.5 h后,计数溶血空斑数。

1.2.6 迟发型变态反应(DTH) 实验结束前5 d,小鼠腹腔注射2%(V/V)绵羊红细胞(SRBC),致敏后4 d测量左后足距厚度,然后在测量部位皮下注射20%(VN)SRBC,每鼠注射20 μL,注射后24 h测量左后足距部厚度,同一部位测量三次,取均值。以攻击前后足蹈厚度差值(足距肿胀度)来表示DTH的程度[25]。

1.2.7 小鼠脾淋巴细胞转化 无菌环境下取出小鼠脾脏,置于装有 5 mL Hank’s 液(无菌)的平皿中,并将纱布置于脾脏上方,用一次性注射器内芯,轻微用力将脾脏磨碎,制备脾细胞悬液。用Hanks液洗2次,每次离心10 min(1000 r/min),将细胞悬浮于1 mL RPMI1640完全培养液中,调整细胞浓度为 3×l06个/mL。将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中,每孔1 mL,一孔加入75 μL ConA液,另一孔作为对照,置于5% CO2、37 ℃培养箱中培养72 h。培养结束前4 h,每孔吸取上清液0.7 mL,加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI1640培养液,同时加入MTT 50 μL,继续培养4 h。培养结束后,每孔加入l mL酸性异丙醇,吹打均匀使紫色结晶完全溶解,在570 nm波长处测定OD值,以加 ConA孔的OD值减去不加ConA孔的OD值表示淋巴细胞增殖能力[26]。

1.3 数据处理

实验均重复3次以上,以Excel软件建立数据库,使用SPSS软件中Dunnett检验方法进行统计分析,实验结果用平均值±标准差表示,显著水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 小分子阿胶肽(LMWPC)蛋白质含量及分子量分布的测定结果

采用凯氏定氮法测定了LMWPC中的蛋白质含量,结果显示LMWPC中的主要成分为蛋白质,含量高达(88.84±1.77) g/100 g。应用高效凝胶色谱法对小分子肽分子量(MW)分布进行测定,获得LMWPC的分子量分布如图1所示。测定标准品的出峰时间(如图2所示),用各自标准样品的分子量取对数的lgMw并与保留时间作图得到线性关系,回归方程为:y=-0.227x+6.991,R2=0.963。根据标准曲线测定结果,经回归方程计算发现LMWPC的分子量绝大部分分布在1000 Da以下,并由4个主要片段组成,由右向左四个峰对应的分子量分别为:66、105、223和581 Da。

图1 小分子阿胶肽的高效凝胶色谱图Fig.1 High performance gel chromatogram of LMWPC

图2 标准样品的高效凝胶色谱图Fig.2 High performance gel chromatogram of standard samples

LMWPC是以阿胶为原料,使用现代生物酶解技术,将传统阿胶大分子蛋白或多肽,进行进一步的水解,使其分子量进一步减小,以期减弱阿胶的滋腻之性[27]。经本研究的测定发现,LMWPC不但蛋白质含量丰富,而且酶解后的相对分子量分布在1000 Da以下。分子质量的降低使阿胶具有较好的溶解性,减轻了阿胶的滋腻性,使机体更容易消化吸收,从而提高了阿胶的生物利用度[28]。刘元涛等[29]研究发现经仿生酶解后的阿胶<3000 Da的小肽含量增加、分子量降低,且仿生酶解后的阿胶比普通阿胶具有更好的提高小鼠抗缺氧能力、游泳时间、胸腺和脾脏指数以及耐寒能力的效果。

2.2 小分子阿胶肽(LMWPC)对小鼠血清溶血素水平的影响

研究表明,阿胶能够显著提高血液白细胞水平,从而提高机体的免疫能力[30]。小分子阿胶为阿胶水解物,同样具有良好的免疫调节功能。血清溶血数(半数溶血值,HC50)和抗体生成细胞检验(溶血空斑实验是体外检测单个抗体形成细胞B淋巴细胞)的测定常被用来检测机体体液免疫的功能状态[31]。LMWPC对小鼠血清溶血素水平的影响如图3所示,高剂量组(1.05 g/kg·bw)小鼠的半数溶血值(HC50)与对照组(63.6±5.5)比较差异性极显著(P<0.01),可达76.8±4.2;低剂量组和中剂量组的小鼠HC50分别为69.3±4.1和68.6±5.7,与对照组相比差异显著(P<0.05)。该实验结果表明LMWPC能明显增加小鼠血清溶血素水平,对小鼠的体液免疫功能有增强作用。崔金玉[32]研究发现阿胶丁、蛤粉炒阿胶珠和微波制阿胶珠都可以提高正常小鼠巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数,同样证明阿胶可以提高小鼠的免疫能力。

图3 小分子阿胶肽对小鼠血清溶血素水平的影响Fig.3 Effect of LMWPC on the rite ofblood serum hemolysin in mice注:*表示与对照组相比差异显著(P<0.05);**表示与对照组相比差异极显著(P<0.01);图4～图6同。

2.3 小分子阿胶肽(LMWPC)对小鼠脾细胞抗体生成的影响

图4为LMWPC对小鼠脾细胞抗体生成的影响结果,小分子阿胶低聚肽0.35 g/kg·bw中剂量组小鼠的溶血空斑数(×103/全脾)与对照组比较差异性显著(P<0.05);低、高剂量组小鼠的溶血空斑数与对照组的差异均无显著性(P>0.05),这可能是由于低剂量下的LMWPC对小鼠脾细胞抗体生成的影响不显著,而高剂量的LMWPC抑制小鼠脾细胞抗体生成导致的。实验结果表明,中剂量(0.35 g/kg)的LMWPC显著增加了空斑的形成,进一步促进B细胞的转化,促进B细胞产生抗体,增强机体的体液免疫功能。付英杰等[33]研究表明,不同给药途径的阿胶低肽均可显著增加模型小鼠脾重指数,表现出一定的免疫增强作用。卢艳等[22]研究发现阿胶枣能够调节小鼠体液免疫功能,调节小鼠巨噬细胞吞噬能力,同时不同剂量的阿胶枣未见免疫抑制现象。LMWPC源于阿胶,在某种程度上能够代表阿胶的功能活性,因此本研究的实验对象LMWPC和阿胶枣均表现出了类似的免疫调节能力。

图4 小分子阿胶肽对小鼠脾细胞抗体生成的影响Fig.4 Effect of LMWPC on hemolytic antibody in mice

2.4 小分子阿胶肽(LMWPC)对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响

狭义的细胞免疫(cellular immunity)仅指T细胞介导的免疫应答,其特征是出现以单核细胞浸润为主的炎症反应和/或特异性的细胞毒性[34]。广义的细胞免疫还包括原始的吞噬作用以及NK细胞介导的细胞毒作用。细胞免疫是清除细胞内寄生微生物的最为有效的防御反应,也是排斥同种移植物或肿瘤抗原的有效手段[35]。小鼠迟发型变态反应实验和ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化的测定常被用来检测细胞免疫的功能状态[18]。图5为LMWPC对小鼠DTH的影响结果,由图5可知对照组小鼠足趾肿胀为(0.27±0.06) mm,低剂量组小鼠足趾肿胀与对照组比较无显著性差异;中、高剂量组小鼠足趾肿胀分别为(0.34±0.07) mm和(0.35±0.03) mm,与对照组相比差异极显著(P<0.01),因此0.35 g/kg中剂量组和1.05 g/kg高剂量组LMWPC对SRBC诱导的小鼠足趾肿胀厚度具有明显增强作用。由于SRBC是细胞免疫的诱导剂,实验组小鼠足趾肿胀程度的增加,说明LMWPC能够通过增强机体的细胞免疫功能而增加足趾的肿胀。张珣等[36]研究表明,阿胶同样能够增加小鼠血清溶血素含量,增强小鼠的迟发型变态反应和脾淋巴细胞的增殖能力;并且能显著提升免疫低下模型小鼠的胸腺指数、小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数;还能调节血清中免疫细胞因子的水平,表明阿胶对小鼠特异性及非特异性免疫机能具有显著调节作用。

图5 小分子阿胶肽对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响Fig.5 Effect of LMWPC on thedelayed hypersensitivity in mice

2.5 小分子阿胶肽(LMWPC)对小鼠脾淋巴细胞转化的影响

LMWPC对小鼠脾淋巴细胞转化的影响结果如图6所示,实验小鼠经口灌胃LMWPC 30 d后,与对照组OD值(0.253±0.082)比较,低剂量组OD值(0.280±0.074)和中剂量组OD值(0.315±0.067)小鼠的脾淋巴细胞转化差异均无显著性(P>0.05);而高剂量组(OD值0.344±0.052)对小鼠脾淋巴细胞的增殖能力最强,差异极显著(P<0.01)。因此,1.05 g/kg高剂量LMWPC能够明显增加脾淋巴细胞的成熟,从而促进T淋巴细胞介导的细胞免疫反应,最终增强机体的免疫功能。安梦培等[37]发现阿胶能显著提高免疫低下小鼠的体液免疫和细胞免疫,提高CD3+、CD3+CD4+阳性细胞比例,但是对非特异性免疫无明显影响。巢警殳[38]研究发现林蛙皮生物活性肽能够提高诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力和ConA诱导的小鼠迟发型变态反应能力,具有增强机体细胞免疫功能。小分子阿胶肽与林蛙皮生物活性肽均来源于动物皮,因此可能均有相似的免疫调节功能。

图6 小分子阿胶肽对小鼠脾淋巴细胞转化的影响Fig.6 Effect of LMWPC on theblastisation of spleen lymphocyte in mice

3 结论

本研究通过凯氏定氮及分子量分析实验证明LMWPC的蛋白质含量丰富,分子量主要集中在1000 Da以下;利用小鼠免疫实验模型,发现LMWPC能够通过增加小鼠血清溶血素水平、增加小鼠脾细胞抗体生成、增强小鼠迟发型变态反应和促进小鼠脾淋巴细胞转化增殖,提高小鼠的体液免疫及细胞免疫功能,对小鼠的免疫功能有正向调节作用。本研究为LMWPC及相关系列食品的开发提供科学依据。