(淮北师范大学生命科学学院,淮北师范大学信息学院,资源植物生物学安徽省重点实验室,安徽淮北 235000)

女贞子是木犀科植物女贞(LigustrumlucidumAit)的成熟果实,性味甘、苦、凉,归肝、肾经,具有补益肝肾、滋阴清热、明目乌发等功效,能治疗慢性支气管炎、骨质疏松症[1-2]、急性黄疽型肝炎和慢性病毒性肝炎,具有提高机体免疫力[3]、抗衰老[4]、降血糖[5-6]、调血脂[6]、抗肥胖[7]、抗肿瘤[3,8]、保肝[9]等作用。熊果酸(Ursolic Acid,UA)和齐墩果酸(Oleanoic Acid,OA)是女贞子发挥药理作用的主要有效成分之一[10]。

熊果酸传统的提取方法有浸提和索氏提取[11]。近年来,超临界CO2流体萃取[12]、微波提取[13-14]、超声提取[15]等新技术应用在熊果酸提取及分离纯化上。超临界CO2流体萃取具有选择性好、提取时间短、提取效率高、产品杂质少、萃取剂无毒无害、溶剂用量少、绿色环保等优点,但提取条件要求较高、成本高、高温高压,存在安全隐患[16]。超声提取是利用空化作用导致细胞破裂,增加溶剂的传质,具有提取时间短、提取温度低及溶剂用量少等特点,但仍存在一些问题而难以大规模工业化推广[17]。微波提取具有时间短、能耗低、效率高、选择性强、溶剂用量少、环境污染小等特点[18-20]。一般采用正交设计或响应面法优化微波辅助提取熊果酸工艺。因此,本研究以女贞子为原料,以女贞子中熊果酸提取量为评价指标,在单因素的试验基础上,采用Box-Behnken响应面法优化分析,从而确定微波辅助提取女贞子中熊果酸的工艺,以期为女贞子深入研究及熊果酸工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

女贞子 采收于淮北师范大学校区,经薛建平教授鉴定为木犀科植物女贞的成熟果实,干燥后经超微粉碎机粉碎备用;熊果酸标准品(含量94.7%) 中国药品生物制品检定所;无水乙醇、高氯酸、冰醋酸、香草醛等 均为国产分析纯。

CW-2000型超声-微波协同萃取仪 上海新拓微波溶样测试技术有限公司;FDV 型超微粉碎机 北京环亚天元机械技术有限公司;DU 700 型紫外/可见分光光度计 美国贝克曼公司。

1.2 实验方法

1.2.1 女贞子中熊果酸提取方法 分别称取5.00 g女贞子粉,加入一定浓度的乙醇溶液在一定微波功率下浸提一定时间,静置冷却,抽滤后,用85%的乙醇溶液定容至250 mL得含有熊果酸的待测溶液。

1.2.2 女贞子中熊果酸提取单因素研究

1.2.2.1 乙醇浓度的选择 称取5.00 g女贞子,按料液比1∶20 g/mL加入65%、70%、75%、80%、85%、90%的乙醇溶液,在微波功率400 W,萃取180 s后,冷却、抽滤定容得含有熊果酸的待测溶液。

1.2.2.2 微波功率的选择 称取5.00 g女贞子,按料液比1∶20 g/mL加入85%的乙醇溶液,分别在100、200、300、400、500、600 W的微波功率下,萃取180 s后,冷却、抽滤定容得含有熊果酸的待测溶液。

1.2.2.3 料液比的选择 称取5.00 g女贞子,按1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL的料液比分别加入85%的乙醇溶液,在微波功率400 W下,萃取180 s后,冷却、抽滤定容得含有熊果酸的待测溶液。

1.2.2.4 浸提时间的选择 称取5.00 g女贞子,按料液比1∶20 g/mL加入85%的乙醇溶液,在微波功率400 W下,分别萃取60、90、120、150、180、210、240、270 s后,冷却、抽滤定容得含有熊果酸的待测溶液。

1.2.3 响应面试验 采用Minitab 15软件中的Box-Behnken方法设计试验。根据单因素试验结果,以乙醇浓度(X1)、微波功率(X2)、液料比(X3)、提取时间(X4)为自变量,以女贞子中熊果酸提取量(Y)为响应值,设计四因素三水平响应面优化试验,响应面试验设计因素与水平如表1。

表1 Box-Benhnken响应面分析试验因素与水平Table 1 Factors and levels in theBox-Benhnken experimental design

表中各自变量编码值与真实值之间的关系分别为:x1=(X1-85)/5,x2=(X2-400)/100,x3=(X3-20)/5,x4=(X4-150)/30。

1.2.4 熊果酸含量的测定

1.2.4.1 标准曲线的制定 准确称取干燥至恒重的熊果酸标品10.00 mg,用无水乙醇溶解并定容至100 mL,得浓度为100 μg/mL熊果酸标准溶液。准确吸取熊果酸标准溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL分别置于试管,在85 ℃水浴锅中挥干溶剂后,加入5%香草醛醋酸溶液0.50 mL及高氯酸1.00 mL摇匀,将试管置于60 ℃水浴中保温15 min,冷却至室温,加入冰醋酸5.0 mL,摇匀后放置15 min显色,在546 nm波长处测定吸光度[21]。以熊果酸标准品含量(μg/mL)为横坐标,吸光度为纵坐标,得线性回归方程:A=0.0072C-0.0461,R2=0.9997。

1.2.4.2 女贞子中熊果酸含量的测定 取女贞子提取液1.00 mL置于试管中,在85 ℃水浴锅中挥干溶剂后,加入5%香草醛醋酸溶液0.50 mL及高氯酸1.00 mL摇匀,将试管置于60 ℃水浴中保温15 min,冷却至室温,加入用冰醋酸5.0 mL,摇匀后放置15 min显色,在546 nm波长处测定吸光度。根据线性回归方程换算成提取液中的熊果酸含量,并按下式计算其熊果酸提取量。

式中:c为提取液中熊果酸含量(mg/mL);V为提取液的总体积(mL);m为女贞子质量(g)。

1.3 数据处理

所有的试验均重复3次,利用Minitab 15和Excel 2007统计软件对试验结果进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 乙醇浓度对女贞子中熊果酸提取效果的影响

不同乙醇浓度对女贞子中熊果酸提取量的影响结果如图1。由图1可知,女贞子中熊果酸提取量随乙醇浓度的增大而增加,乙醇浓度为85%时,熊果酸提取量最大,为4.373 mg/g。且根据相似相溶原理,85%乙醇水溶液的极性与女贞子中熊果酸的极性最接近,所以选取85%为自变量乙醇浓度的零水平。

图1 乙醇浓度对熊果酸提取量的影响Fig.1 Effect of ethanol concentrationon the extraction yield of ursolic acid

2.2 微波功率对女贞子中熊果酸提取效果的影响

不同微波功率对女贞子中熊果酸提取量的影响如图2。由图2可知,微波功率低于400 W时,熊果酸提取量随着微波功率的增大而提高;当微波功率超过500 W,熊果酸提取量随着微波功率的升高而降低。通过对400 W与500 W功率条件下熊果酸提取量的显著性分析,发现差异不显著,因此选取400 W为自变量微波功率的零水平。

图2 微波功率对熊果酸提取量的影响Fig.2 Effect of microwave poweron the extraction yield of ursolic acid

2.3 料液比对女贞子中熊果酸提取效果的影响

不同料液比对女贞子中熊果酸提取量的影响见图3。由图3可知,料液比在1∶10～1∶20 g/mL范围内,熊果酸提取量随料液比的增大而显著提高(P<0.05),当料液比超过1∶20 g/mL时,熊果酸提取量增加的趋势变缓,这是由于女贞子中熊果酸质量分数是一定的。综合考虑提取溶剂的成本及熊果酸提取液真空浓缩的效率等问题,其料液比控制1∶20 g/mL左右为宜。

图3 料液比对熊果酸提取量的影响Fig.3 Effect of solid-to-solvent ratioon the extraction yield of ursolic acid

2.4 浸提时间对女贞子中熊果酸提取效果的影响

不同浸提时间对女贞子中熊果酸提取量的影响见图4。由图4可知,随微波时间的增加,熊果酸提取量呈先迅速增加后缓慢降低的趋势。是因为随微波时间增加的过程中,女贞子细胞破裂加剧,熊果酸溶出率提高[22]。当浸提时间150 s时,熊果酸提取量达到最大,所以,选取150 s为自变量时间的零水平。

图4 浸提时间对熊果酸提取量的影响Fig.4 Effect of extraction timeon the extraction yield of ursolic acid

2.5 响应面法优化女贞子中熊果酸的提取工艺

2.5.1 响应面试验结果及回归模型建立 响应面试验方案与结果见表2。

表2 响应面试验方案及结果Table 2 Experimental design and correspondingresults for response surface analysis

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

注:*表示差异显著(P<0.05);**表示差异极显著(P<0.01);表4同。

表4 回归方程系数的显著性检验Table 4 Significance test of regression coefficients in regression model

2.5.2 方差分析 表3的方差分析表明,该模型极显著(P<0.01),而失拟项不显著(P>0.05),表明响应值熊果酸提取量实际值与预测值之间具有较好的相关性。由表4可知,一次项X1、X2、X3和X4极显著(P<0.01),说明乙醇浓度、微波功率、液料比和浸提时间对女贞子中熊果酸提取量的影响是极显著的。交互项X3X4极显著(P<0.01),说明料液比和浸提时间交互项对女贞子中熊果酸提取量极显著影响,交互项X1X3和X2X4显著(P<0.05),说明乙醇浓度和料液比及微波功率和浸提时间交互项对女贞子熊果酸提取量的影响显著。二次项X12、X22、X32和X42对女贞子中熊果酸提取量的影响也极显著(P<0.01)。

2.5.3 响应面分析 微波辅助提取女贞子中熊果酸的响应面和等高线见图5,从图5A可知,曲面比较陡峭,说明乙醇浓度、微波功率对熊果酸提取量影响显著,但两者的交互作用不显著(P=0.514),等高线图接近圆形。从图5B可知,曲面比较陡峭,同时等高线是椭圆形,说明乙醇浓度、料液比及交互作用对熊果酸提取量影响显著。从图5C可知,乙醇浓度与浸提时间对熊果酸提取量影响显著,但两者的交互作用不显著(P=0.148),等高线图接近圆形。从图5D可知,料液比与微波功率对熊果酸提取量影响显著,但两者的交互作用不显著(P=0.067),其等高线图接近圆形。从图5E和图5F可知,曲面比较陡峭,等高线呈椭圆形,说明微波功率、浸提时间与料液比及它们交互作用对熊果酸提取量影响显著。

图5 熊果酸响应面图及等高线图Fig.5 Response surface and contour plots for ursolic acid

2.5.4 女贞子中熊果酸最佳提取工艺条件的确定和实验验证 利用Minitab 15软件对试验模型进行典型性分析,获得熊果酸提取工艺最佳参数:乙醇浓度为88.5%、微波功率为479 W、料液比为1∶23.4 g/mL、微波浸提时间为166 s,女贞子中熊果酸提取量预测值为4.681 mg/g。考虑到实际操作的便利,确定女贞子中熊果酸微波辅助提取的工艺参数为:乙醇浓度为88%、微波功率为480 W、料液比为1∶23 g/mL、微波浸提时间为166 s。为证实预测的结果,用试验中得到的最佳提取工艺参数做3次平行实验,其熊果酸平均提取量为(4.653±0.087) mg/g,与预测值相对误差为0.47%,说明该方程预测值与实验值相吻合。与郑艳等[23]研究结果相比,女贞子熊果酸提取量相近,但提取时间由120 min缩短为166 s,因此具有较好应用前景。

3 结论

在单因素试验基础上,以熊果酸提取量为响应值,利用Minitab 15软件优化分析,各因素对女贞子中熊果酸提取量的影响大小顺序为:乙醇浓度>浸提时间>微波功率>液料比,其中料液比与浸提时间交互作用极显著,料液比与乙醇浓度及浸提时间与微波功率交互作用显著。优化后的女贞子中熊果酸提取艺条件为:乙醇浓度88%、微波功率480 W、料液比1∶23 g/mL、微波浸提时间166 s。在此优化条件下,女贞子中熊果酸提取量为(4.653±0.087) mg/g。