,4,*

(1.贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳 550025;2.贵阳学院食品与制药工程学院,贵州贵阳 550005;3.贵州茅台酒厂(集团)习酒有限责任公司,贵州遵义 564622;4.贵州省果品加工工程技术研究中心,贵州贵阳 550005)

刺梨(RosaroxburghiiTratt)又名茨梨,一种野生小灌木,是西南地区常见的野生植被,含有大量的酚类化合物,成熟的刺梨果实表面呈黄色且单宁酸含量高,涩味重。是贵州省种植面积最大的野生果树资源[1],果实含有丰富的维生素C[2]、超氧化物歧化酶(SOD)[3]、类黄酮[4]、以及氨基酸[5]等多种有效物质,在营养、保健和医药方面具有极高的研究利用价值[6]。目前,国内对于刺梨果渣自然发酵过程中微生物变化方面研究比较少,刺梨在加工过程当中,品相不佳和有机械损伤的果子经常被丢弃,刺梨果渣作为刺梨果压榨后的副产物,常作为农作物废弃物,既浪费资源又造成环境污染。利用废弃的刺梨果渣进行发酵,对刺梨果渣自然发酵过程中细菌群落结构进行分析,了解发酵过程中细菌菌群的变化规律,能更好地为贵州刺梨产业发酵方向提供有效的数据,并且在一定程度上提高刺梨资源利用度,促进资源合理利用。

近年来,在微生物群落多样性研究中分子生物学研究手段受到重视[7-10],不同环境下的样本由于来源和条件是不可控制的,Illumina Mi Seq高通量测序技术(又称下一代测序技术)能快速、精准地了解样品之间菌群的构成和功能分析以及菌群之间的差异性,该技术在微生物分子生态学[11]、病原生物学[12]、食源性病原体快速检测[13]等应用广泛。高通量测序技术不需要对样本中的微生物进行分离纯化,可直接对样本中基因组DNA进行分析,能一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定,有效反映出菌群物种丰度和差异性[14-17]。

因此本研究利用Illumina Mi Seq高通量测序技术检测自然发酵刺梨果渣中细菌群落的结构及多样性,为刺梨发酵工业提供有利的菌种资源,同时为后期刺梨发酵技术提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

刺梨 采自贵州省龙里县刺梨种植基地;红糖 市购;DNA抽提试剂盒(E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit) 美国欧米茄公司;Qubit3.0 DNA检测试剂盒 美国生命技术公司;2×Taq Master Mix 南京诺唯赞生物科技有限公司;MagicPure Size Selection DNA Beads 北京全式金生物科技有限公司;细菌通用引物(341F,805R) 生工生物工程(上海)股份有限公司。

Pico-21台式离心机 赛默飞世尔科技公司;GL-88B漩涡混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司;TND03-H-H混匀型干式恒温器 深圳拓能达科技有限公司;DYY-6C电泳仪电源、DYCZ-21电泳槽 北京市六一仪器厂;凝胶成像系统 美国UVP;T100TM Thermal Cyele PCR仪 美国伯乐公司;Q32866Qubit® 3.0荧光计 美国英杰生命技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 刺梨发酵液制备 先将10 L的白色塑料桶用75%的酒精经表面杀菌后备用,将榨汁后(刺梨果出汁率约为60%)的刺梨果粉碎,参照朱丽梅[18]等方法,将刺梨果渣、水、红糖按3∶10∶1的比例装在塑料桶中,摇匀,密封发酵,每隔6 d放一次气搅拌并取样,连续发酵60 d。

1.2.2 样品总DNA的提取 样品前处理:取2 mL发酵液样品,加入到已灭菌的离心管中,在10000 r/min离心3 min,弃上层液,沉淀倒置吸水纸上1 min,滤干。

样品总DNA的提取:具体提取步骤参照OMEGA试剂盒使用说明书操作,然后再利用1%琼脂糖凝胶检测DNA完整性,再进行下一步分析。

1.2.3 细菌16S rDNA基因PCR扩增 利用DNA检测试剂盒对基因组DNA精确定量,以确定PCR反应需要加入的DNA量。PCR所用的引物已经融合了Miseq测序平台的V3-V4通用引物(341F,805R)[19]。

将配置好的PCR体系(30 μL体系)按照下列条件进行PCR扩增:94 ℃预变性3 min,94 ℃变性处理30 s,45 ℃退火20 s,65 ℃延伸30 s,5个循环;94 ℃变性处理20 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,20个循环,72 ℃延伸5 min。PCR结束后进行第二轮扩增,引入Illumina桥式PCR兼容引物,配置好的PCR体系(30 μL体系)按照如下反应条件进行PCR扩增:95 ℃预变性3 min,94 ℃变性处理20 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,5个循环;72 ℃延伸5 min,降温到10 ℃。扩增完成后,回收PCR产物并纯化。

1.2.4 Illumina Mi Seq高通量测序 将所得到的PCR产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行高通量建库和细菌多样性分析。测序完成后进行DNA序列拼接和质量控制,并以此为基础进行生物学信息分析[20]。

1.2.5 多样性分析 根据OTU聚类分析的结果,采用Mothur在OTU相似水平在97%的条件下计算多样性指数,包括OTU数量、香农指数、Chao1指数、森普森指数、Ace指数和覆盖率指数[21]。

1.2.6 群落组成分析 利用blastn将OTU序列与相应数据库进行比对,观测样品在不同分类水平上的群落结构,筛选出OTU序列的最适比对结果并在默认满足相似度>90%的基础上,选取不同分类水平上的细菌群落进行统计分析,根据分析结果,利用软件绘制所有样本群落结构分布柱状图、物种可视化圈图等进行群落组成分析[22]。

1.3 数据处理

数据处理采用R语言和mothur(https://mothur. org/wiki/Chao/Ace/Shannon/Simpson/Coverage)软件进行分析,利用cutadapt(https://pypi.org/project/cutadapt/1.2.1/)去除接头,PEAR(https://cme.h-its.org/exelixis/web/software/pear/)进行序列对拼,Prinseq(http://prinseq.sourceforge.net/)质量剪切。测序获得的基因序列与Silva[23](http://www.arb-silva.de/)、NCBI 16S(http://ncbi.nlm.nih.gov/)、RDPhttp://rdp.cme.msu.edu/misc/resources.jsp数据库进行比对。

表1 质量控制后序列统计总表Table 1 Summary of sequence statistics after quality control

表2 Alpha多样性指数统计表Table 2 Alpha diversity index statistical

2 结果与分析

2.1 琼脂糖凝胶电泳鉴定

由图1琼脂糖凝胶电泳可知,PCR扩增产物电泳条带均在584 bp左右,且条带长度和亮度较好,表明DNA含量较高,可继续进行实验。

图1 发酵刺梨果渣细菌群落16S rDNA PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCRamplified product of bacterial communityin fermented Pyrus spinosa fruit residue注：点样顺序(从左到右):Marker,时间为6、12、18、24、30、36、42、48、54和60 d,Marker。

2.2 物种多样性分析

测序数据QC(质量控制)之后序列统计如表1所示,原始reads总数目为689755,QC之后剩余reads总数目为665308条优质条带。通过绘制OTU数目变化与聚类similarity值之间的关系图,similarity数值达0.97%可进行下一步分析[24]。

Alpha多样性指数统计如表2所示,刺梨果渣在分别发酵6、12、18、24、30、36、42、48、54和60 d时间点上,10个样品的OTU数量和ACE指数在发酵6和12 d总体变化不大;ACE指数用来估计群落中OTU数目的指数,ACE指数在12和18 d值最大,表明了12～18 d随着发酵的进行发酵刺梨果渣中细菌群落丰度逐渐增大;发酵24 d以后样本中的OTU数量和ACE指数开始下降;在发酵54 d时Ace指数最大,达1311.29,说明发酵到第54 d时已达到发酵的最高时期,发酵最后60 d物种多样性开始下降。香农指数用来反映微生物多样性,指数越大,群落多样性越高,对10个样本中的香农指数随着发酵时间的变化可知,在发酵6 d时香农指数较高,其次是12 d,表明刚开始发酵到12 d时,刺梨果渣中细菌群落多样性逐渐增高,其余发酵时间香农指数相对较稳定。森普森指数用于估算样品中微生物多样性指数之一,森普森指数值越大,说明群落多样性越低,由表2可知,发酵到18 d时样本多样性最低。发酵过程中10个样本的覆盖率均在99%以上,甚至在发酵18、24、和30 d时覆盖率达100%,表明了测序的数据能够覆盖目前状态下样品中的细菌种类,测序量已经达到最大值,能够真实映射样本中的细菌群落情况,可以用于后续的分析。Chao1指数在发酵前6、12和18 d时值最高,一般Chao1指数在生态学中常用来估计物种总数,细菌群落物种总数最高,说明该阶段的细菌群落最丰富;后期Chao1指数趋于稳定,表明发酵后期细菌群落物种趋于稳定。

2.3 物种组成分析

在门分类水平上,10个样本中共检测到26个门类,其中主要列出前10门类中占优势的四个细菌门如图2所示,分别为变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Actinobacteria)。变形菌门(Proteobacteria)是整个刺梨果渣发酵过程中的优势菌门,发酵起始的平均相对丰度为80.36%,发酵30 d达99.68%,发酵60 d为99.85%,随着发酵的进行,相对丰度先升高后趋于稳定。厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Actinobacteria)在发酵初期比例不大,但一直存在整个发酵过程当中。

图2 细菌门类水平的比较Fig.2 Comparison of bacterial taxa levels

在属分类水平上,在10个样本中共检测到373个细菌属,其中只列出主要的10个属类进行分析,如图3所示。葡糖杆菌属(Gluconobacter)和醋酸杆菌属(Acetobacter)是刺梨果渣发酵过程中占主要的优势菌株。发酵到6 d时醋酸杆菌属(Acetobacter)为0,很有可能因为自然发酵过程中伴随微量的酒精产生,使发酵后期醋酸杆菌属快速生长,并随着发酵的进行逐渐升高,发酵后期趋于稳定。塔特姆菌属(Tatumella)和鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)在发酵过程中相对丰度逐渐降低,但在发酵过程中一直存在。

图3 细菌属分类水平的比较Fig.3 Comparison of taxonomic levels of bacterial genera

2.3 物种的优势菌群可视化分析

在Genus水平上对发酵过程中10个样本微生物丰度的可视化分析如图4所示,在样本与物种的共线性关系图中,右边半圆表示样本的物种丰度组成情况,左边半圆表示在该分类水平下物种在不同样本中的分布比例情况。为了显示效果,仅显示前10个样本和丰度最高的前10个物种。在图4中可以直接看出葡糖杆菌属是绝对的优势菌,发酵6 d时该菌种丰度仅占8.85%,随着发酵进行,葡糖杆菌属逐渐升高,发酵24 d时丰度达到83.79%,后期趋于稳定,发酵结束后丰度达65.37%。醋酸杆菌属在开始6 d时没有生长,18 d为9.22%,随着发酵的进行,呈现先升高后降低的趋势,最后值丰度数值达33.86%。

图4 Genus水平上样本与物种关系图Fig.4 Sample-species relationship at genus level

2.4 细菌群落的主成分分析

对发酵过程中的10个样本减化数据分析后,在相对应的坐标点上有效地找出数据中最主要的变量信息,根据各样本间点的聚集程度和距离,样本间距离越近,说明10个样本的微生物群落相似度越高。由图5可知,刺梨果渣发酵6 d、42和54 d时细菌群落结构与其它发酵时期有明显差异。在主成分1(PC1)和主成分2(PC2)数据集中,对样本方差的贡献率最大,分别达到了62%和32%,共计94%,并且可以代表刺梨发酵过程中微生物变化的绝大部分变量信息,并且刺梨果渣细菌群落随发酵时间的变化过程主要是在PC1和PC2轴上,因此可以将刺梨果渣发酵分为2个时间段:第1时间段为发酵初期(6～24 d),第2时间段为发酵后期(30～60 d)。这种分类表明刺梨果渣在发酵前后细菌群落有一定的差异,发酵前期细菌群落丰富,随着进入发酵后期,葡糖杆菌属占取绝对优势,醋酸菌属其次,这种差异为建立发酵刺梨果渣的监控模型奠定了一定基础。

图5 10个样本基于OTU的PCA图Fig.5 PCA Diagram of 10 samples based on OTU

3 结论

本文采用高通量测序技术对贵州省龙里县刺梨种植基地的刺梨果渣在自然发酵过程中(0～60 d)的细菌群落结构及多样性进行分析,分析共检测出24个门类、40个纲类群、74个目类群、162个科类群、373个属类群。在整个发酵过程中,主要以葡糖杆菌属和醋酸杆菌属为主。虽然发酵后期葡糖杆菌属和醋酸菌属大量生长繁殖,成为整个发酵过程中的优势菌群,使其它细菌相对丰度降低,但这些菌群在发酵过程中一直存在,所以总体上细菌的多样性变化趋势并不大,这很大程度上有可能是因为发酵过程一直处于密封环境中,容器中的微量氧气慢慢被消耗,发酵后期逐渐形成厌氧环境,微好氧菌快速繁殖,抑制其它菌群生长,使菌群中比例占优势的好氧菌大量减少而造成的[25]。

通过高通量测序技术可以全面掌握刺梨果渣发酵过程中微生物的多样性和丰度变化,在一定程度上了解刺梨果渣自然发酵过程中的微生物菌群结构和动态变化规律,为今后发酵刺梨果渣的菌株筛选和发酵工艺奠定基础。