张 晔,刘志伟,谭兴和

(湖南农业大学食品科技学院,食品科学与生物技术湖南省重点实验室,湖南长沙 410000)

虾青素(3,3′-二羟基-4,4′-二酮基-β,β′-胡萝卜素,C40H52O4)是一种脂溶性酮式类胡萝卜素,具有极强的抗氧化作用,其自由基抗氧化活性比维生素E高500倍,比β-胡萝卜素高38倍[1]。同时,虾青素还具有抗癌[2]、增强免疫系统[3]、抵抗组织损伤[4]和心血管疾病等功能[5]。近年来已被广泛应用于化妆品[6]、医药[7]、保健品[8]及水产养殖领域[9]。虾青素主要存在于各种微生物以及微藻中,其中雨生红球藻是天然虾青素最主要的来源[10-11]。雨生红球藻是一种单细胞双鞭毛微藻,在逆境条件下(强光、高温、营养盐(氮、磷)饥饿、高盐)经过一系列的形态变化最终形成一种含较高虾青素含量的成熟红色、非运动性囊胞[12]。其虾青素积累量最高可达藻细胞干质量的4.0%以上,远远高于水产品废弃物(虾、蟹等甲壳)中和红发夫酵母(Phaffiarhodoxyma)(0.15%～0.4%)中虾青素的含量[13]。但成熟的雨生红球藻厚而致密的细胞壁导致有机溶剂很难直接渗透到细胞内部,影响胞内虾青素提取效率[14],因此雨生红球藻破壁处理成为虾青素提取的关键工艺。

目前常用的虾青素提取方法主要有超声波辅助和微波辅助提取[15]、有机溶剂浸提[16]、酶法辅助提取[17]、超临界流体萃取法[18]以及高压均质法[19]。超声波和微波辅助提取设备昂贵、并且Zhao等[20]发现采用超声波辅助和微波辅助提取会降低虾青素的生物活性。直接使用有机溶剂浸提不仅耗费时长,且提取率较低,Sarada等[21]使用了多种有机溶剂进行浸泡提取,其中最好的一种有机溶剂提取率也只有22%。超临界流体CO2萃取法成本较高,不适用于工业化大规模生产。高压均质法对均质机设备要求较高,且在生产中设备零件损耗较大,常常不能连续生产。相较于其他几种方法,酶法具有反应条件温和、设备操作简单、用料少、产品纯度高等优点,被认为是最具潜力的一种提取方法。Kobayashi等[22]使用了纤维素酶和裂解酶处理雨生红球藻,有效地获得了虾青素但并没有具体探讨工艺参数对虾青素提取率的影响。

雨生红球藻细胞壁是由纤维素蛋白和果胶物质组成的复杂网状结构,采用纤维素酶和果胶酶能够水解植物细胞壁,提高生物细胞壁和细胞膜的通透性,加速细胞内溶物质流出功能[23-24]。溶菌酶同样能够有效地降解细胞壁的成分,有助于细胞内营养物质的释放[25-26]。因此,本文采用了纤维素酶、果胶酶和溶菌酶三种单酶以及四种不同比例的复合酶辅助破壁提取雨生红球藻虾青素。通过响应面法对酶法提取条件进行了优化,旨在为工业化大规模生产提供一定的参考条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

雨生红球藻粉 云南省白鸥生物技术有限公司,纯度:3.5%;纤维素酶(酶活力:400 U/mg) 上海瑞永生物科技有限公司;果胶酶(酶活力:500 U/mg) 上海瑞永生物科技有限公司;溶菌酶(酶活力:20000 U/mg) 上海瑞永生物科技有限公司;乙酸、乙酸钠、甲醇均(分析纯) 国药集团化学试剂有限公司。

H-8数显恒温水浴锅 上海浦东物理化学光学仪器厂;TGW16台式高速微量离心机 长沙英泰仪器有限公司;WFJ-7200型可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司;AL-204电子天平(精确至0.0001 g) 上海梅特勒-托利多仪器有限公司;PHS-3C pH计 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料的预处理 雨生红球藻粉末冷冻干燥后用铝箔纸密封储存于-18 ℃中备用。

1.2.2 酶法提取雨生红球藻中虾青素工艺 参考Liu等[27]的方法,固定料液比为10∶1 (mg/mL)准确称取10 mg雨生红球藻粉末置于10 mL连盖离心管中,加入1 mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液,调节pH,分别加入一定量的纤维素酶、果胶酶、溶菌酶以及复合酶(纤维素酶∶果胶酶=1∶1 (U/U);纤维素酶∶果胶酶=2∶1 (U/U);纤维素酶∶果胶酶=1∶2 (U/U)纤维素酶∶果胶酶∶溶菌酶=1∶1∶1 (U/U/U)),在预定条件下进行酶解反应,灭酶后用9000 r/min的离心机离心10 min,取离心沉淀物加入4 mL甲醇在50 ℃水浴锅中提取1 h,收集上清液再加4 mL甲醇于50 ℃水浴锅中提取1 h,合并两次上清液,备用。

1.2.3 酶法提取雨生红球藻中虾青素单因素实验

1.2.3.1 酶的种类和酶含量大小对雨生红球藻虾青素提取率的影响 酶法提取过程中,影响提取率最重要的因素是酶的种类和酶含量大小。为了探究这些因素对虾青素提取率的影响规律,对反应条件进行了设置:在大量预实验的基础上控制酶解温度为50 ℃,酶解pH为5.0,酶解时间为6 h,比较单一酶(纤维素酶、果胶酶、溶菌酶)、复合酶(纤维素∶果胶酶=1∶1,U/U;纤维素∶果胶酶=2∶1,U/U;纤维素酶∶果胶酶=1∶2,U/U;纤维素酶∶果胶酶∶溶菌酶=1∶1∶1,U/U)在加酶量为5000、6000、7000、8000、9000、10000 U/mL时对雨生红球藻中虾青素提取率的影响,每个处理组设3个重复。

1.2.3.2 酶解时间对雨生红球藻虾青素提取率的影响 选取提取率最高的一组酶,固定酶解温度50 ℃、pH5.0,加酶量为7000 U/mL,分别测定酶解时间为4、5、6、7、8 h对雨生红球藻虾青素的提取率的影响。每个处理组设3个重复。

1.2.3.3 酶解温度对雨生红球藻虾青素的影响 选取提取率最高的一组酶,固定酶解pH5.0、酶解时间6 h,加酶量为7000 U/mL,分别测定了酶解温度30、40、50、60、70 ℃对雨生红球藻虾青素提取率的影响。每个处理组设3个重复。

1.2.3.4 酶解pH对雨生红球藻虾青素的影响 选取提取率最高的一组酶,固定酶解时间6 h、酶解温度50 ℃,加酶量为7000 U/mL,分别测定了酶解pH3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0对雨生红球藻虾青素提取率的影响。每个处理组设3个重复。

1.健全完善巡视工作制度体系。认真梳理已经建立的规章制度，学习借鉴上级出台的制度规范，针对企业巡视工作的现实和长远需要，制定完善配套制度，形成与企业巡视工作发展相适应的系统规范、配套完善的制度体系。研究制定巡视工作领导小组、办公室和巡视组工作规范，巡视工作有关事项移交督办办法，巡视发现重大问题线索的处理办法，巡视工作成果运用协调机制等规章制度，使巡视工作的制度体系在巡视实践中得到不断丰富和完善。

1.2.4 响应面试验 在单因素试验结果基础上,选择纤维素与果胶酶酶活力配比为(1∶1,U/U),加酶量为7000 U/mL,以酶解温度、酶解时间和pH作自变量,进行响应面试验,以虾青素提取率为指标,确定复合酶提取雨生红球藻虾青素的最佳工艺参数。试验因素水平编码见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平Table 1 Coded values and corresponding actual values of theoptimization paramters used in response surface analysis

1.3 虾青素含量的测定。

采用美国Cyanotech公司[28]的方法测定虾青素的含量。得到的上清液稀释适当倍数于476 nm处测定吸光值,甲醇用于空白测定。提取率表示提取得到的虾青素占雨生红球藻中虾青素总量的比例。按下列公式进行计算。

X(mg)=C×8×15

式中：C:类胡萝卜素的含量;A:476 nm处的吸光值;250:消光系数。

X:类胡萝卜素的质量;8:甲醇的体积;15:稀释倍数。

Y:雨生红球藻中虾青素的提取率;M:样品的质量(mg);80%:类胡萝卜素中虾青素的含量;3.5%:藻粉中虾青素的含量。

1.4 数据分析

利用Origin 8.5、Design-Expert 8.0和SPSS 18.0数据处理系统对试验结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 酶的种类和加酶量对雨生红球藻虾青素提取率的影响 结果如图1所示,不同种类的酶对雨生红球藻虾青素的提取率均随着酶添加量的增加呈现先增大后缓慢下降的变化趋势。造成这种现象的原因主要是因为酶解底物有限,当酶解反应达到饱和时,继续增大加酶量会引起酶的竞争性抑制作用,导致提取率的降低[29]。

图1 酶种类和酶活力大小对雨生红球藻中虾青素提取率的影响Fig.1 Effects of type and activity of enzymeon the yield of astaxanthin from H. pluvialis注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05);图2～图4同。

2.1.2 酶解时间对雨生红球藻虾青素提取率的影响 如图2所示,当酶解时间小于6 h时,虾青素提取率间具有显著差异(P<0.05),虾青素的提取率随着酶解时间的增加而增大,由53.64%升高到了70.19%;并且在6 h时,虾青素的提取率达到最大,为70.19%,酶解反应在4～6 h内,复合酶的活性逐渐达到最大,能够充分地与红球藻细胞壁组织结构反应,增强了酶的渗透效果,促进了细胞内次生代谢产物的流出。继续延长酶解时间提取率反而有所下降,由70.19%下降到66.85%。出现这种变化趋势的原因主要是因为在一定时间范围内,随着酶解时间的延长,酶解反应逐渐反应彻底,超出一定时间范围后,继续延长反应时间反而会抑制酶活性的发挥。此外,从雨生红球藻中释放出的虾青素不稳定,长时间暴露于外部环境中可能发生氧化降解反应,因此延长提取时间内观察到虾青素提取率降低可能反应了由于氧化导致虾青素的损失[31-32],所以选择最佳酶解时间为6 h。

图2 酶解时间对雨生红球藻虾青素提取率的影响Fig.2 Effect of hydrolysis time on theyield of astaxanthin from H.pluvialis

2.1.3 酶解温度对雨生红球藻虾青素提取率的影响 如图3所示,不同的酶解温度对虾青素的提取率均具有显著性差异(P<0.05)。当温度低于50 ℃时,随着温度的升高,虾青素的提取率也随之升高,从48.76%升高到了70.08%,并且在50 ℃提取率达到最大;当温度超过50 ℃时,虾青素提取率急剧下降,从70.08%下降到了40.70%。造成该趋势的主要原因是因为在一定温度范围内,酶的活性会随着温度的升高逐渐升高,当达到酶的最大活性时,继续升高温度酶受热发生变性,导致酶活力的降低甚至失活,从而减缓的虾青素的提取率。这一结果与Zuorro等[33]使用酶法提取微藻中油脂的报道一致。并且温度过高对虾青素的结构也会造成一定的破坏。因此选择最佳酶解温度为50 ℃。

图3 酶解温度对雨生红球藻虾青素提取率的影响Fig.3 Eeffect of hydrolysis temperatureon the yield of astaxanthin from H.pluvialis

2.1.4 酶解pH对雨生红球藻虾青素提取率的影响 如图4所示,当pH低于5.0时,虾青素提取率随着pH的升高逐渐升高且具有显著性差异(P<0.05),由48.41%升高到了70.11%,并且在pH为5.0时达到最大;当pH超过5.0时,虾青素的提取率显著下降(P<0.05),由70.11%下降到了48.96%。说明pH过大过小都会对酶解反应造成较大的影响,只有在最适的pH范围内,酶与底物才会充分结合,酶解反应速度达到最大。因此,当纤维素-果胶酶复合酶的pH在5.0左右时,其酶活性最好,对雨生红球藻细胞壁的降解和破坏达到最大。李亚辉等[34]使用纤维素酶和果胶酶复合提取芦荟多糖也是在酸性范围内获得最佳pH。所以选择最佳酶解pH为5.0。

图4 pH对雨生红球藻虾青素提取率的影响Fig.4 Effect of pH values on theyield of astaxanthin from H. pluvialis

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验设计结果 响应面设计:固定加酶量为7000 U/mL,复合酶中纤维素酶和果胶酶酶活力配比为1∶1 (U∶U),以酶解时间(A)、酶解温度(B)和酶解pH(C)为自变量,以雨生红球藻虾青素提取率为响应值,结果见表2。用Design-Expert 8.0软件对表三数据进行回归拟合,得到雨生红球藻虾青素提取率对上述3个自变量的二次回归方程:Y=69.95-1.44A-3.32B-1.15C-4.34AB+2.22AC-3.00BC-4.58A2-15.12B2-6.67C2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Experimental design and correspondingresults for response surface analysis

2.2.2 回归模型方差分析 对回归模型及其系数进行显著性检验(表3),结果表明该试验选用的模型极显著(P<0.0001),方差失拟项不显著(P=0.3820>0.05),说明模型的选择是合理的;此外,回归模型的总决定系数R2=0.9883,表明二次回归方程与试验结果的拟合度良好,可以用于复合酶提取雨生红球藻虾青素的分析与预测。同时,从表3结果还可以得出酶解温度(B)、酶解pH和酶解温度交互项(AB)、酶解温度和酶解时间交互项(BC)、酶解pH二次项(A2)、酶解温度二次项(B2)、酶解时间二次项(C2)极显著(P<0.01),酶解pH(A)、酶解pH和酶解时间交互项(AC)均显著(P<0.05),说明这几个因素对虾青素提取率影响较大,根据F值大小,可知影响因素的主次顺序为:A(酶解温度)>B(酶解pH)>C(酶解时间)。

表3 二次多项式回归模型的方差分析Table 3 Analysis of variance the regression model

2.2.3 响应面分析与最优条件的确定 为了进一步分析酶解时间、酶解温度和酶解pH对响应面值的影响,固定其中的1个因素,使其处于中心水平,绘制其他两个因素交互作用的响应面,对两因素的相互作用进行分析。图5所示的3组响应面及等高线的形状可以分析出随着各因素水平的升高或延长,虾青素的提取率均呈现先增大后减少的变化特征。并且,响应面的陡峭程度和等高线的形状可以反应两因素之间的作用显著程度。其中,响应面越陡,等高线的形状越偏向椭圆表明两因素之间的交互作用越显著。由图c可以清楚的看出酶解温度和酶解pH之间的交互作用最显著,且等高线沿酶解温度轴变化更加密集,而沿pH轴变化相对稀疏,最后结合响应面的陡峭程度得出酶解温度对虾青素提取率的影响要大于酶解pH。同理,由图a、b可以得出酶解时间对虾青素提取率的影响要低于酶解温度和酶解pH,这与表3方差分析结果一致。

图5 各因素交互作用对雨生红球藻虾青素提取率影响的响应面与等高线图Fig.5 Response surface and contour plots showingthe effects of interactions among different factorson the extraction yield of astaxanthin from H.pluvialis

2.2.4 提取工艺的优化与验证 通过Design-Expert 8.0分析优化,得出酶法提取雨生红球藻中的虾青素的最佳工艺条件为酶解时间5.91 h、酶解pH4.93、酶解温度49.19 ℃,在此条件下,虾青素的提取率预测值为70.21%。

为了验证响应面优化的可行性,采取优化后的条件进行酶法提取雨生红球藻中虾青素的验证实验。考虑到操作的可行性,将酶解时间设为6 h、酶解pH4.9,酶解温度为49 ℃,在此条件下进行了5次重复试验。经上述优化后的条件提取后,雨生红球藻中虾青素的平均提取率为71.08%,与预测值相比,相对误差为1.2%,因此响应面优化后的条件是可行的,具有实用价值。

3 结论

本实验在单因素的基础上,利用响应面法对复合酶提取雨生红球藻虾青素的条件进行了优化,并建立了可靠的二次多项模型。通过方差分析表明,模型的拟合度较好。在纤维素酶和果胶酶酶活力配比1∶1 (U/U),加酶量7000 U/mL条件下,优化最优组合为:酶解时间6 h、酶解pH4.9、酶解温度为49 ℃。在此条件下重复5次实验得到的平均提取率为71.08%±0.26%,与预测值相对误差为1.2%,具有良好的拟合度。其中采用混合有机溶剂直接浸提法[35]和变频微波辅助提取法[36],得到的虾青素提取率分别为36.21%和36.88%,相比之下采用复合酶法能够使虾青素的提取率得到大幅度的提升。可为工业化大规模生产提供一定的参考价值。