赵俊峰 李豪 肖耀军 雷震 张林超 孙继建 潘世杰 崔洪泉 陈瑞廷

(1河南省中医院 河南中医药大学第二附属医院泌尿外科，河南 郑州 450002；2武警广东总队医院泌尿外科，3河南省中医院 河南中医药大学第二附属医院中心实验室)

肾细胞癌(RCC)为泌尿系统常见的恶性肿瘤，占成人恶性肿瘤3%～5%，其发病率有逐年上升趋势〔1〕。即使通过外科手术治疗，仍有20%～40%的患者在术后发生侵袭和远处转移〔2,3〕。因此寻找中药治疗肾癌成为热点,其中千金子为大戟科类干燥以后成熟的种子，现代药理学研究已经表明其对肾癌〔4〕、肝细胞癌〔5〕、前列腺癌〔6〕及血液系统的恶性肿瘤细胞〔7〕均具有不同程度的抗肿瘤效果。本研究以小鼠肾癌Renca细胞为实验对象，通过体外细胞实验检测千金子对肾癌细胞周期的影响及其侵袭转移能力的影响，为后续的实验研究提供依据。

1 材料和方法

1.1材料与试剂 千金子二萜醇实验用药品购买自四川维克奇生物科技有限公司，纯度为99%(批号：20190023)；胎牛血清、RPMI-1640细胞培养基、胰蛋白酶均购自美国Sigma公司；双抗(青霉素、链霉素)购买自武汉汉恒生物科技有限公司；细胞6孔板和Transwell小室均购自美国Corning公司；AnnexinV-FITC细胞周期的试剂盒购买自上海碧云天生物科技有限公司。小鼠肾癌Renca细胞购自北京鼎国昌盛生物科技有限公司，由河南中医药大学第二附属医院中心实验室保存。

1.2方法

1.2.1细胞培养 小鼠肾癌Renca细胞放置在含5%CO2、37℃的细胞恒温箱中，含有双抗(100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素)10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养基常规培养，待细胞饱和度达到80%～85%后，使用胰蛋白酶消化细胞后并进行传代培养，取对数生长期的细胞用于本实验。

1.2.2千金子作用前后对肾癌Renca细胞形态学的影响 取预先复苏的细胞，使用含有0.25%的胰蛋白酶消化细胞后，调整细胞的浓度为3×105/ml，并接种到6孔板中。常规的条件下培养24 h后，等细胞完全贴壁，换液1次，实验孔滴加预先稀释的千金子二萜醇，对照孔滴加等量的培养基。培养24～48 h后，于倒置显微镜下随机拍照，记录细胞形态学的变化。

1.2.3划痕实验检测千金子对肾癌Renca细胞迁移能力的影响 取对数期生长的细胞，用含有0.25%的胰蛋白酶消化后收集肾癌Renca细胞，随即接种到6孔板中密度为1×105/孔，待细胞贴壁后，使用无血清培养基饥饿6 h，用200 μl的枪头垂直于6孔板划“1”字形的划痕，再用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次。加入浓度为(9 000 μg/ml)的千金子二萜醇，以加入培养基组作为对照组。在划痕时开始和千金子处理24 h后，在倒置显微镜下观测划痕的宽度并拍照。

1.2.4Transwell小室检测千金子对肾癌Renca细胞侵袭转移能力的影响 采用Transwell小室法体外迁移实验观察和处理48 h后肾癌Renca细胞迁移能力的变化，同样取对数生长期肾癌细胞，经胰蛋白酶消化细胞后，收集细胞调整细胞密度为1×105/ml，PBS水化小室的基底膜，同时向小室下层内添加500 μl不含胎牛血清的RPMI-1640细胞培养基，小室膜上均加入100 μl细胞悬浮液。实验组滴加9 000 μg/ml的千金子二萜醇溶液，对照组滴加培养基。放置于37℃、5%CO2饱和湿度细胞恒温箱中培养48 h后，用含4%的多聚甲醛固定30 min、0.1%的结晶紫染色20 min以后，并取出里边的小室，擦去没有穿过小室膜的细胞，在显微镜下，随机取5个视野(上、下、左、右、中间)观察Transwell小室并进行细胞计数，实验的结果取均值，并独立重复3次。

1.2.5细胞增殖周期的检测 取对数生长期的肾癌Renca细胞，用单纯RPMI1640调整细胞密度为2×105/ml，均匀加样于6孔板中置于细胞恒温培养箱中常规培养24 h贴壁后备用。实验组加入千金子二萜醇(9 000 μg/ml)，对照组加入体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养基，预处理细胞；常规培养24 h后，收集各孔细胞。用预冷的PBS冲洗细胞2次后，将细胞重悬于0.5 ml PBS液中，迅速注入75%的预冷乙醇(4℃)冰箱固定过夜。测定时离心弃上清液2次，将细胞重悬于0.5 ml的PBS液中，加入0.5 ml的碘化丙啶(PI)溶液(含10 mg/L的RNase、0.1%Triton-100、50 mg/L PI)4℃避光染色30 min,经过尼龙网过滤以后，上流式细胞仪检测细胞周期，所得实验结果利用Modfit软件分析。试验独立重复3次。

1.3统计学分析 采用SPSS24.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1千金子对肾癌Renca细胞形态学的影响 9 000 μg/ml的千金子二萜醇作用于肾癌Renca细胞24 h后，大部分细胞体积变小、变细短圆钝；部分细胞出现凋亡的特征，细胞内出现凋亡小体，有细胞碎片漂浮。见图1。

图1 千金子对肾癌Renca细胞形态学的影响(×100)

2.2千金子对肾癌Renca细胞侵袭与转移能力的影响 千金子二萜醇处理肾癌Renca细胞48 h后，穿过小室膜的细胞数量〔(116.51±15.26)%〕与对照组〔(563.23±39.61)%〕比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3千金子对肾癌Renca细胞迁徙能力的影响 与对照组相比较，实验组肾癌细胞的迁移距离明显缩短，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2及表1。

图2 千金子对肾癌Renca细胞迁徙能力的影响(×100)

表1 千金子对Renca细胞迁移距离的影响

与对照组比较：1)P<0.05，下表同

2.4千金子对肾癌Renca细胞周期的影响 与对照组比较，实验组细胞G0/G1期细胞明显增加，S期细胞明显减少(P<0.05),G2/M期的细胞无明显变化(P>0.05)。见表2。

表2 千金子对肾癌Renca细胞周期的影响

3 讨 论

本研究基于前期发现中药千金子二萜醇浓度为9 000 μg/ml时对小鼠肾癌Renca细胞存在明显的抑制作用〔8〕，更进一步探讨其对肾癌细胞周期和侵袭转移能力的影响。肿瘤是细胞增殖周期调控机制出现紊乱，最终导致细胞无限制地进行分裂增殖。在临床上抗肿瘤药物的机理有许多是通过阻断肿瘤细胞的分裂周期从而抑制癌细胞的增殖。Choene等〔9〕研究发现千金子乙醇提取物作用于人肾癌细胞后，G2/M期的细胞数量明显增加，随着药物浓度提高处于G0期细胞数量随之增多。本实验结果显示，千金子可以使小鼠肾癌Renca细胞G0/G1期细胞明显增加，S期细胞数量减少，G2/M期细胞无明显变化。Cheng等〔4〕研究中药千金子作用于乳腺癌(mda-mb 231)等细胞株后，处于G0/G1期细胞数量显著增多，与本研究的结果一致，表明中药千金子在不同的细胞引起细胞周期的阻滞可能并不完全一致。此外，癌细胞侵袭与转移是影响预后的另一重要的因素，也是肿瘤治疗失败的主要原因。本研究通过Transwell小室实验及体外细胞划痕实验，与对照组相比较，发现千金子可以有效降低肾癌Renca细胞侵袭、转移和迁徙的能力。另外，Yang等〔10〕的研究结果也表明千金子通过抑制人肺癌A549细胞肿瘤血管的生成来阻断其侵袭和转移，与本研究的结果基本相符。近年来研究表明PI3K-AKT-mTOR信号传导通路广泛存在于多种细胞中，完成并参与细胞包括增殖、分裂、凋亡、侵袭、转移及血管生成等生物学行为〔11,12〕；该信号通路的表达失控与多种癌细胞的发生发展有关，针对PI3K-AKT-mTOR信号通路分子靶向治疗成为当前研究的热点〔13〕。千金子与通过该信号通路调控肾癌Renca细胞生物学行为的分子机制之间的关系，有待后续的研究。