原发性肝癌（PHC）是临床常见的恶性肿瘤，主要包括肝细胞癌、肝内胆管细胞癌和肝细胞癌-肝内胆管细胞癌混合型等不同病理类型，其中肝细胞癌（HCC）占90%以上。我国的肝癌发病率占全世界肝癌的55%，而我国死于肝癌的人数占全世界死于该疾病的45%[1]。PHC具有起病隐匿、症状不明显、进展迅速等特点，很多PHC患者因得到确诊治疗时已经达到局部晚期或已经发生远处转移，从而失去了外科手术治疗的最佳时机。目前化疗药物的副作用比较大，对器官和细胞的选择性较小，杀死肿瘤细胞的同时对正常细胞也有极大伤害，治疗并不能取得很好的临床疗效，致使肝癌患者有较高的复发率，较易发生转移。我们通过分析32例肝细胞癌患者病情，利用免疫组化技术及RT-PCR技术检测FHL2在肝细胞癌中的表达情况。初步探讨FHL2在肝细胞癌中可能发挥的作用，观察其对肝细胞癌生物学行为的影响，分析FHL2与肝细胞癌的相关性及其作用机制，为了探索肝癌基因治疗合适的靶位，我们对转录因子FHL2在肝癌中的表达情况进行研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料选择我院32例肝细胞癌患者，手术前均未接受放疗和化疗，送检时间为2011年1月～2013年12月。其中男18例，女14例；年龄45～79岁，平均（54.6±3.6）岁。依原发性肝癌的TNM分期（2010年UICC/AJCC国际分期）和肿瘤直径是否大于5cm将32例患者分为两组，分别为A组（Ⅰ期+Ⅱ期），肿瘤直径≤5cm，B组（Ⅲ期+Ⅳ期），肿瘤直径＞5cm，每组16例。两组患者分别按性别、年龄、是否感染乙型肝炎病毒三项指标进行比较，差异无统计学意义（P>0.05），有可比性。见表1。

表1 两组患者一般资料比较[n（%）]

1.2 实验试剂RNAiso Reagent购自Takara公司，胰蛋白酶购自Merk公司，Trizol总RNA提取试剂、RT-PCR试剂盒购自北京Invitrogen公司，SP免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，EDTA、DAB购自福州迈新生物技术有限公司，全自动免疫组化仪配套试剂、全自动免疫组化仪二抗、全自动免疫组化仪购自罗氏公司，FHL2鼠单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.3 方法

1.3.1 组织处理 ①取组织块剪碎后加入胰酶，通过离心后收集肝癌细胞置于培养瓶中；②吸弃培养基后在收集的肝癌细胞中加入RNAiso Reagent，吸取含肝癌细胞的裂解液至离心管中，随后在室温下静置 5min。4℃条件下 12 000r/min 离心 15min；③吸取上清液转移至另一支新的离心管中，向上清液中加入等体积（1/5体积的RNAiso Reagent）的异丙醇，充分混匀后室温下静置10min；④在4℃条件下12 000r/min离心10min，离心后观察试管底部，可见沉淀。向沉淀中加入75%的乙醇1ml，然后4℃条件下12 000r/min离心5min，并尽量彻底地弃去乙醇。室温条件下干燥沉淀5min，然后加入适量的RNasefree水并充分溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后置于-80℃冰箱保存。

1.3.2 RNA浓度测定 ①将核酸蛋白分析仪打开，调整屏显稀释倍数为50，预热30min；②用三蒸水清洗比色杯3次，并用三蒸水调零；③向比色杯中加入98μl双蒸水，接着加入2μl待测样本，轻轻混匀后放入核酸蛋白分析仪中。共读数3次，然后取平均值。

1.3.3 免疫组化 ①石蜡切片厚度为3～5μm；②在60℃恒温烤箱中烘烤60min；③二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中依次脱蜡，每缸5min；④依次无水乙醇Ⅰ1min、无水乙醇Ⅱ 30s、95% 乙醇 30s、85% 乙醇 30s、75%乙醇30s脱去二甲苯至蒸馏水冲洗；⑤0.01M（pH 7.2）磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤 3次，每次 5min；⑥室温下3%双氧水阻断10min，PBS洗涤3次，每次5min；⑦抗原修复：加入EDTA缓冲液放置于微波炉中在10档3min，高压锅沸水浴7min，温水孵育30min，自然冷却后PBS洗涤3次，每次5min；⑧弃多余的液体，10%山羊血清封闭，放置30min；⑨弃去多余血清，滴加一抗后，置于4℃冰箱中过夜；⑩37℃复温半小时，PBS洗涤3次，每次5min；滴加二抗，在室温下孵育30min，PBS洗涤3次，每次5min；DAB显色：加入充分混匀新鲜配制的DAB溶液，使其显色3～10min；PBS反复洗涤3次，每次5min；放入苏木素中复染细胞核1min，用自来水充分冲洗后，投入盐酸-乙醇分化液中分化胞浆3s，蓝化；依次投入75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ脱水后，投入二甲苯透明，使用中性树胶封固。

1.4 结果分析抗体免疫组化定位后，通过光学显微镜观察，并拍照记录。所有照片均使用同一光学显微镜（BX51型，日本OLYMPUS公司生产）在相同条件下拍摄，因此消除了实验误差。拍摄过程中要保持稳定的显微镜光源亮度，在固定的曝光时间内拍照，其中曝光度选择在最高亮度值230附近。对于抗体表达阳性的区域，即照片显示有黄色或棕黄色的区域累积光密度（IOD SUM）及目标区域面积使用 Image-pro plus6.0（IPP6.0）软件测定，每一例经免疫组化定位的病理切片选择5个400×视野进行拍照并认真分析，之后由IPP导入Excel表格，并依此计算平均光密度值（mean density），计算公式为平均光密度=IOD SUM/目标区域面积，最后将每个病例5个400×视野的平均光密度值的均值作为免疫组化的分析结果。

1.5 统计学方法采用SPSS 13.0统计学软件进行统计学分析，以P<0.05为差异有统计学意义。组织标本FHL2 mRNA表达水平的实时荧光PCR结果进行Mann-Whitney U检验，所有的检测均选择双尾检验且通过 SigmaStat 3.1 软件（Systat Software，Inc，Richmond，CA）实现。

2 结果

2.1 FHL2表达与肝癌进展分期的相关性

2.1.1 RT-PCR结果 患者肝癌组织中FHL2有少量表达，A组和B组肝癌组织中FHL2的mRNA相对表达量显著高于对应癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 两组患者肝癌及癌旁组织FHL2 mRNA相对表达量（±s）

表2 两组患者肝癌及癌旁组织FHL2 mRNA相对表达量（±s）

注：P为分别与癌旁组织比较

分组 n FHL2 mRNA 相对表达量 P A组 161.56±0.0740.048 B组 161.38±0.0430.025癌旁组织 320.43±0.065

2.1.2 免疫组化结果 患者肝癌组织中有FHL2的表达，并且胞浆及胞核中均有表达，A组患者肝癌组织FHL2的表达高于B组，癌旁组织中几乎没有表达。见表3、图1。

表3 两组患者肝癌及癌旁组织FHL2表达平均光密度值

图1 肝癌及癌旁组织中FHL2免疫组化结果（400×）

2.2 FHL2表达与肝癌临床疗效相关性免疫组化结果显示，FHL2在经手术及化疗后缓解或未缓解患者的肝癌细胞核及胞浆中均有表达，病情缓解患者肝癌细胞中FHL2的表达高于经治疗病情稳定或进展患者。见图2、表4。

图2 两组患者肝癌组织中FHL2免疫组化结果（400×）

表4 不同预后患者肝癌及癌旁组织表达FHL2平均光密度值（±s）

表4 不同预后患者肝癌及癌旁组织表达FHL2平均光密度值（±s）

预后 n FHL2平均光密度值 P病情缓解患者 160.42±0.0230.00病情稳定或进展患者 160.27±0.042

2.3 FHL2表达与肝癌患者是否感染肝炎病毒相关性RT-PCR结果显示，患者肝癌组织中有少量的FHL2表达，A组患者肝癌组织FHL2的表达高于B组，差异有统计学意义（P<0.05）；两组组内感染乙型肝炎病毒与未感染病毒患者肝癌组织中FHL2的表达差异无统计学意义（P>0.05）。见表5。

表5 两组感染与未感染乙型肝炎病毒患者肝癌组织中FHL2的mRNA相对表达量

3 讨论

原发性肝癌常见组织病理学类型包括肝细胞癌（hepatic celluler cancer，HCC）、肝内胆管细胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）和肝细胞癌 -肝内胆管细胞癌混合型，其中HCC占90%以上，多数患者确诊时已是晚期或发生远处转移，失去外科手术治疗的机会。因此，人们对新的治疗方法如基因治疗、免疫治疗、靶向肿瘤干细胞治疗等生物治疗手段的关注越来越多[2]。

转录因子FHL2在肿瘤的发生、发展过程中均有非常重要的作用。FHL2是LIM蛋白家族LIM-only亚类中的成员，LIM蛋白是有一个或多个LIM结构域且可参与调节蛋白与蛋白之间相互作用的蛋白质[3]。FHL2蛋白在不同组织的细胞分化及恶性肿瘤的发生方面发挥着重要作用，鉴于不同的肿瘤细胞类型，转录因子FHL2发挥着转录协同因子的作用，能促进或抑制肿瘤的生长[4，5]。与正常肝组织相比，肝母细胞瘤中FHL2 mRNA有较高水平的表达，β-catenin是该瘤常见的突变体，与FHL2一样，是共活化物β-catenin/TCF/LEF介导的转录，参与肝母细胞瘤的形成，β-catenin有增强转录的功能[6～8]。研究发现，过量表达FHL2基因的多种细胞株中其均能诱导细胞凋亡[9～11]。FHL2蛋白在FHL家族中研究最为深入，以体外实验为主，并且发现FHL2蛋白能与50多种蛋白相互作用[12]，通过有选择地使用LIM结构域的不同区域，参与不同细胞的信号通路而发挥其生物学功能。FHL2已被证实参与多种人类疾病的发生、发展[13]。实验表明FHL2在许多组织的细胞分化及癌症发生方面有重要作用，它能发挥转录共调节因子的功能，是雄激素受体（androgen receptor，AR）、激活蛋白 l（activatorprotein 1，AP-1）、cAMP 响应元件结合蛋白（cAMP responsive element binding protein，CREB）及胰岛素样生长因子结合蛋白（insulin-like growth factorbinding protein 5，IGFBP-5）等多种转录因子的共调节因子；它参与调控器官的发育、细胞的分化、染色质的重建、细胞凋亡以及肿瘤的发生、发展过程[14]。研究表明，FHL2基因表达可以诱导肿瘤细胞的分化，抑制其生长[15]。

本研究采用免疫组化法及RT-PCR法检测不同临床分期患者肝癌组织的FHL2表达情况，比较不同临床分期患者FHL2表达的差异。肝癌及癌旁组织RT-PCR结果显示，临床分期为Ⅰ期和Ⅱ期的患者肝癌组织FHL2的表达高于临床分期为Ⅲ期和Ⅳ期患者，癌旁组织表达量很低，差异具有统计学意义（P<0.05）。免疫组化结果显示，FHL2在胞核及胞浆中均有表达。临床分期为Ⅰ期和Ⅱ期的患者肝癌组织FHL2的表达高于临床分期为Ⅲ期和Ⅳ期患者，癌旁组织基本没有表达。经平均光密度值检测，结果显示临床分期为Ⅰ期和Ⅱ期的患者肝癌组织表达FHL2确实高于临床分期为Ⅲ期和Ⅳ期的患者，且差异有统计学意义（P<0.05）。癌旁组织内FHL2的表达很低，与肿瘤组织表达FHL2比较差异有统计学意义（P<0.05）。有研究表明，FHL2在肝癌组织中的表达明显下调，其抑制肿瘤发生发展[16]。根据本研究免疫组化及RT-PCR结果，FHL2在肝癌临床分型为Ⅰ期和Ⅱ期的患者肝癌组织中表达高于临床分期为Ⅲ期和Ⅳ期的患者，提示FHL2在肝癌中主要起抑制作用，在Ⅲ期和Ⅳ期患者中低表达，Ⅲ期和Ⅳ期患者的肝癌病情进展更快。

免疫组化显微镜下观察显示经手术及化疗治疗缓解患者肝癌组织FHL2表达高于治疗后病情稳定或进展患者。经平均光密度值检测，结果显示治疗缓解患者肝癌组织FHL2表达高于治疗后病情稳定或进展患者，且差异具有统计学意义（P<0.05）。FHL2在肝癌组织中起抑制作用，治疗缓解患者肝癌组织FHL2表达高于治疗后病情稳定或进展患者，说明缓解患者高表达的FHL2能够抑制肝癌的进一步发展，因此治疗后疗效更好。在肝癌的基因治疗中，可以考虑促进FHL2的表达以抑制肝癌病情的发展，也可以将肝癌组织中FHL2的表达量作为预测肝癌疗效的指标。

RT-PCR结果显示，Ⅰ期和Ⅱ期感染与未感染乙型肝炎病毒患者FHL2表达差异无统计学意义（P>0.05），Ⅲ期和Ⅳ期感染与未感染乙型肝炎病毒患者FHL2表达差异也无统计学意义（P>0.05），感染乙型肝炎病毒的Ⅰ期和Ⅱ期肝癌患者FHL2表达高于Ⅲ期和Ⅳ期患者（P<0.05）。说明是否感染乙型肝炎病毒对肝癌组织表达FHL2并无影响。因此，转录因子FHL2在肝细胞癌组织中的表达与进展分期及临床疗效有明显的相关性，可以作为肝细胞癌分期的辅助诊断标准及预测临床疗效的指标，并且可以作为肝癌基因治疗的新靶点，值得临床推广应用。