杨丽华，徐香琴

(湖南科技学院，湖南 永州 425199)

车前子为车前科车前属植物车前(Plantagoasiatica L.)或平车前(P.depressa Willd.)的干燥成熟种子，性味甘寒，入肾、膀胱、肝、肺经，具有利水通淋、渗湿止泻、清肝明目、清热化痰的功效[1]。现代研究表明，车前子是一种非常丰富的自然资源，具有很高的药用价值，主要化学活性成分包括黄酮类[2-5]、苯乙醇苷类[6-8]、环烯醚萜类[9]、多糖类[10-11]等，尤其是其中的黄酮类化合物。本文采用单因素试验、正交试验设计对永州车前子总黄酮提取工艺进行优化，并对不同采收时间的车前子中总黄酮的提取率进行考察，确定车前子总黄酮的最佳采收时间，为车前子的采收时间提供理论依据。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

1.1.1 仪器

722-B紫外分光光度计，天津市普瑞斯仪器有限公司；JA3003电子分析天平，上海舜宇恒平科学有限公司；SJB-III循环水式多用真空泵，郑州长盛实验仪器有限公司。

1.1.2 试剂

实验样品：不同采收时间的车前子采摘于湖南永州，鼓风干燥箱干燥，粉碎，密封，室温保存。

试剂：芦丁标准品(JS90103)购自上海金穗生物科技有限公司；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均为分析纯，购自天津市大茂化学试剂厂。

1.2 实验方法

1.2.1 车前子总黄酮含量的测定[12-13]

1.2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品10 mg，置50 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，配成浓度为0.2 mg/mL的芦丁对照品溶液。

1.2.1.2 供试品溶液的制备

取车前子粉末(过40目筛)约1.0 g，精密称定，加30 mL 70%乙醇回流提取60 min，取出，放冷，滤过，滤液用70%乙醇定容于50 mL量瓶中，摇匀，即得。

1.2.1.3 标准曲线的制备

精密量取芦丁对照品溶液 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，分别置10 mL刻度试管中，分别加70%乙醇至5.0 mL，加 一定量的5%亚硝酸钠溶液，混匀，静置6 min，加适量10%硝酸铝溶液，混匀，静置6 min，加适量4%氢氧化钠溶液，再加70%乙醇至刻度，摇匀，静置一定时间，即得。同法制成阴性对照溶液。照紫外-可见分光光度法，测吸光度值，以对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线。

1.2.1.4 车前子总黄酮的提取

1.2.2 单因素试验

取车前子粗粉约1 g，精密称定，在其他条件平行的情况下，分别对不同乙醇浓度(40%、50%、60%、70%、80%)、液料比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)、提取次数(提取1、2、3次)进行单因素考察，然后确定最佳提取条件。

1.2.3 正交实验设计

由于正交试验具有“均衡分散”的特点，为了进一步探讨车前子的提取工艺的最佳提取条件、选择影响较为显著提取温度(A)、提取时间(B)、料液比(C)和乙醇浓度(D)为考察因素，采用L9(34)正交设计，确定最佳提取工艺参数。

1.2.4 车前子总黄酮含量测定

按照正交实验确定的最佳提取工艺，比较不同采收时间的车前子中总黄酮提取率。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

根据总黄酮测定方法，得归方程为：y=5.1521x+0.0732。式中y为510 nm处吸光度值，x为稀释后的标准品待测液的质量浓度，溶液在0.008～0.08 mg/mL质量浓度范围内有较好的线性关系(图1)。

图1 芦丁标准曲线

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 乙醇浓度对车前子黄酮提取率的影响

图2 乙醇浓度对车前子黄酮提取率的影响

由图2可知，乙醇浓度对车前子总黄酮提取率的影响较大，其变化的趋势为先增长后降低，在乙醇浓度50%时提取率达到最大值，考虑50%乙醇为最佳提取浓度。

2.2.2 料液比对车前子黄酮含量的影响

图3 料液比对车前子黄酮提取率的影响

如图3所示，车前子总黄酮的提取率随着料液比的增加呈先降低后升高再降低的趋势，在料液比为1∶25时提取率最大，达28.36 mg/g，最后确定最佳料液比为1∶25。

2.2.3 提取时间对车前子黄酮提取率的影响

由图4可知，提取时间对车前子的总黄酮提取率影响较大，提取率介于13.63～30.38 mg/g之间，车前子总黄酮的提取率随着回流时间的变化呈先升高后缓慢降低的的趋势，其中在90 min时，提取率达到最大值，为30.38 mg/g，90 min后开始下降，可能是提取时间过长车前子中的黄酮苷类成分开始出现分解，导致其总黄酮的含量开始下降。最终确定车前子总黄酮提取的最佳时间为90 min。

图4 提取时间对车前子提取率的影响

2.2.4 提取次数对车前子提取率的影响

图5 提取次数对车前子黄酮提取率的影响

由图5可知，提取次数对车前子总黄酮的提取率影响并不明显，提取率介于30.32～31.51 mg/g之间，提取率整体呈递增趋势，但是提取2次和提取3次的区别并不大，为了节约时间和溶剂，综合考虑，最终确定提取次数为2次。

2.3 正交试验结果及分析

2.3.1 正交试验结果

表1 正交分析表

为了进一步得到回流提取车前子总黄酮最佳提取率，选择乙醇浓度(A)、料液比(B)、回流提取时间(C)以及提取次数(D)四个因素进行一个四因素三水平的正交试验。实验结果见表1，实验方差分析表2。

表2 方差检验结果

由表1正交分析表可知，车前子总黄酮的提取工艺为：A3B3C3D2，即乙醇浓度60%，料液比1∶30，提取时间120 min，提取次数2次。又由表2方差分析表可知，RA > RC > RD > RB，即各因素的主次为乙醇浓度>提取时间>料液比>提取次数。乙醇浓度对车前子总黄酮提取率的影响最大，为主要因素，在生产上应该把乙醇浓度作为提取的关键因素考虑，料液比和提取时间是重要影响因素，而提取次数为次要因素。

2.3.2 验证实验

为了考察车前子最佳提取工艺(A3B3C3D2)的稳定性，做验证实验，取车前子约1 g，精密称定，分别进行3次平行实验，第1次验证实验结果是的提取率为35.42 mg/g，第2次验证实验的结果是提取提取率为35.61 mg/g，第3次验证实验的结果是提取率为35.72 mg/g。3次试验的提取率都十分相近，平均值为35.58 mg/g，RSD值为0.43%，小于2%，符合要求。最终确定该实验的最佳提取条件为A3B3C3D2。

2.3.3 不同采收时间车前子总黄酮的提取率

取其余批次车前子药材约1 g，精密称定，平行3份，检测，计算不同采收时间车前子中总黄酮的提取率，结果见表3。

表3 不同采收时间的车前子总黄酮提取率

由表3可知，永州江永县6～10月份车前子总黄酮提取率介于35.54～36.75 mg/g之间，其中九月份的提取率最高，达36.75 mg/g。由此可见九月份为永州车前子最佳采收时间。

4 结论

乙醇回流提取法是一种比较经典的黄酮提取方法，成本较低、实用，也能很好的适应工业化生产。本文先对车前子的总黄酮提取率进行单因素考察，再进行正交实验筛选出最佳工艺，最后采用该工艺对不同采收时间的车前子总黄酮提取率进行比较，其中九月份的车前子总黄酮提取率最高，达36.75 mg/g，确定九月份为车前子的最佳采收时期。通过本实验能够为永州车前子总黄酮的工业化生产提供理论依据，也为永州车前子的采收时间提供一定的理论依据。