赵艳杰 冯艳芳 黄思思 马莹雪 李嫒嫒 张 蝶 邓 超 韩瑞玺 唐 浩

（农业农村部科技发展中心，北京 100176）

近年来，随着人们品种权意识的日益增强，且《种子法》中要求品种登记、审定、保护均需要通过特异性（可区别性，Distinctness）、一致性（Uniformity）和稳定性（Stability）的测试（简称DUS测试），因此植物品种DUS 测试工作任务量不断加大，加之我国培育、审定和保护大豆新品种速度的加快，大豆骨干亲本的使用使得品种间的遗传多样性降低，单纯依据表型性状进行品种田间检验越来越困难，因此对DUS 测试技术的要求越来越高[1]。以分子标记为基础的DNA 指纹鉴定技术具有准确可靠、简单快速的优点，指纹图谱是鉴别品种的有力工具[2]，因此建立以分子标记为基础的DNA 指纹图谱能够为特异性（可区别性）判定时辅助筛选近似品种和解决品种纠纷提供技术支持。

我国在大豆DNA 指纹图谱构建方面取得了一定的成果，田清震[3]利用AFLP 分子标记技术，建立了我国代表性野生大豆和栽培大豆种质的指纹图谱。赵洪锟等[4]利用RAPD 分子标记技术，构建了64 份吉林省大豆骨干亲本及主推品种的DNA 指纹图谱。高明[5]利用SSR 分子标记技术构建了89 个吉林省推广大豆品种的DNA 指纹图谱，并进行遗传多样性分析。徐海风等[6]用45 对SSR 引物对43 份大豆品种（系）进行遗传相似性分析，并构建指纹图谱。陈亮等[7]从320 对SSR 标记引物中筛选出由7个SSR 标记构建了吉林省新育成大豆品种的DNA指纹图谱。徐冬雪等[8]以参加2016 年河北省区域试验的21 个大豆品系为材料，用62 对SSR 引物构建了指纹图谱。而针对东北地区申请保护大豆品种DNA 指纹图谱构建和遗传多样性分析还未见报道。

截止到2018 年11 月份，东北地区受保护的大豆品种数量占将近一半，本研究利用均匀分布于大豆染色体的40 对SSR 引物，对东北地区已获得植物新品种权的182 份大豆品种进行遗传分析，同时构建其DNA 指纹图谱库，为DUS 测试中辅助筛选近似品种和解决品种纠纷奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料182 份来自东北地区申请植物新品种保护大豆授权品种（表1）。

1.2 DNA 提取从每个品种中取50 粒种子，放在装有适量湿沙土的发芽盒内于人工气候培养箱发苗，每个样品随机取叶片20 片以上，液氮研磨后，用改良的CTAB 法提取种子DNA[9]。

1.3 SSR 标记检测及数据分析品种区分效果好、峰型易读的40 对SSR 引物由黑龙江省农业科学院作物育种研究所推荐（表2），荧光引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。PCR 体系含1×TaqMan®Gene Expression Master Mix、30ng DNA，加ddH2O 补足20μL。95℃预变性5min，94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s～1min 30s，共32 个循环；72℃延伸10～15min，16℃条件下保存。将PCR 产物进行适当稀释后，取1μL 稀释液加8.5μL 去离子甲酰胺、0.5μL Liz-500 分子量内标，于ABI 3730DNA 分析仪上进行毛细管电泳检测。利用北京市农林科学院玉米中心开发的SSR 指纹分析器采集扩增产物的片段大小。采用Powermarker V3.25 软件进行聚类分析，用Figtree 模块生成聚类图。

2 结果与分析

2.1 SSR 标记多态性分析分析182 份大豆品种40 对SSR 引物标记多态性，共扩增出266 种多态性基因型，每对引物的基因型表现从4～20 种不等，平均每对引物扩增出11.05 种基因型。

2.2 遗传多样性分析利用Powermarker V3.25软件进行遗传相似性分析，结果表明，182 个大豆品种间遗传相似系数的变化范围是0.4887（黑交00-1152 与野褐1 号）～1.0000（龙垦335、合农75 和合丰50 号），平均为0.7785。从聚类分析结果（图1）来看，182 份大豆品种可聚合为13 大类，龙垦331 单独为一类；垦丰16、垦豆26 号、垦豆38、垦豆37、垦豆28、垦豆36、垦豆39、垦豆33 聚合在一起；黑农70、黑农64、黑农68、黑农66、黑农69 聚合在一起，说明上述8 个垦豆系列品种和5个黑农系列品种遗传基础较窄。除此之外，合农系列、吉育系列、绥农系列品种分布较远，说明遗传基础较远。

龙垦335、合农75 和合丰50 号具有相同的DNA指纹，查询DUS 测试数据库中3 个品种的田间表型数据，合农75 和合丰50 号在“下胚轴：花青甙显色强度”等5 个性状上有1 个代码差异，表型相近，合农75 和龙垦335 在“茎：茸毛密度”等14 个性状上有1～3 个代码差异，表型差异较大（表3）。

3 讨论

大豆是高度自交结实作物，遗传基础狭窄。邱丽娟[10]发现18 个美国大豆品种提供了美国85%的育成品种的遗传物质。崔章林[11]分析了中国651 个大豆品种的系谱，认为中国东北、黄淮海地区和南方3 大产区衍生品种最多仅38 个祖先亲本。本研究利用40 对SSR 引物对182 份东北地区已授植物新品种保护权的品种进行分析，发现其平均相似系数为0.7785，遗传基础较窄，又由于育种采用大豆品种同质化严重，加大了DUS 测试中特异性鉴定的难度。除此之外，8 个垦豆系列品种和5 个黑农系列品种紧密聚合在一起，说明同一育种单位育成的新品种遗传多样性低，因此在大豆的新品种选育上可考虑拓宽遗传基础。

表1 182 份来自东北地区申请植物新品种保护大豆授权品种

表2 SSR 标记引物

图1 182 份东北地区申请保护大豆品种UPGMA 聚类图

《种子法》中规定“农业、林业主管部门可以采用国家规定的快速检测方法对生产经营的种子品种进行检测，检测结果可以作为行政处罚依据”。由于基因与性状的关系并不都是简单的线性关系，基因与基因、基因与基因产物、基因与环境之间存在着复杂的相互关系，分子检测结果与田间表型鉴定结果也无必然关联。本研究中，龙垦335、合农75 和合丰50 号DNA 指纹相同，合农75 和合丰50 号表型相近，说明了构建大豆DNA 指纹数据库在特异性（可区别性）判定时辅助筛选近似品种具有一定的参考意义；合农75 和龙垦335 表型差距较大，说明品种特异性（可区别性）的最终判定不能仅仅依靠分子鉴定，还需要依靠田间种植对比试验。

表3 龙垦335、合农75 和合丰50 号的田间鉴定结果