江平

江苏省连云港市妇幼保健院中心实验室，江苏连云港 222002

当前临床对于B 族链球菌 (group B streptococcus，GBS)的筛查主要有实时荧光PCR、细菌培养、核酸探针检测、特异性抗原或抗体测定几种方法，其中细菌培养法一直被视为金标准，不过该检查所需时间很长，同时孕妇生殖系统中细菌种类多，普通培养基中会抑制GBS 的生长，出现漏诊情况[1-2]。 另外选择抗原检测或者抗体检测虽然可以迅速得到检测结果， 不过存在比较明显的假阳性或假阴性率[3]。 针对部分孕期没有筛查GBS 的临产孕妇，在短时间内获得准确的筛查结果非常重要，PCR 检测所需时间短，检测结果具备良好灵敏度，被视作筛查GBS 的有效方法[4-5]。 该研究具体以2017 年10 月—2018 年12 月该院6 710 例妊娠晚期孕妇为对象， 分析实时荧光PCR 技术对于GBS 感染的筛查价值，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

以该院6 710 例妊娠晚期孕妇为对象， 年龄：20～43岁之间，年龄平均（32.66±10.09）岁。 孕妇孕周在35～37 周之间，均为单胎妊娠。 全部孕妇均排除剖宫产分娩；参与研究前1 个月有感染性疾病史； 以往有抗菌素全身使用或者局部使用史。 该研究孕妇均对研究内容知情同意，签订同意书，且研究获得医院伦理委员会批准。

1.2 方法

仪器试剂：B 族链球菌核酸检测试剂盒；PCR 分析仪；微生物鉴定系统；GBS-DNA 提取试剂和扩增试剂盒；API菌种鉴定系统；全自动血培养系统。

采集标本：选择1 无菌拭子深入肛门中，在括约肌上2～3 cm 的位置进行轻轻旋转， 收集孕妇直肠部位的分泌物，同样采集2 次，装入1 个无菌套管中，视作1 份标本，进行密封保存。 另外将孕妇外阴分泌物擦净后选择1 无菌拭子深入孕妇阴道内1/3 处，旋转1 圈后收集阴道分泌物，采集2 次，装入1 个无菌套管中，视作1 份标本，进行密封保存。 标本采集完成后保证在1 h 之内送检。

基因测序检测： 在医学检验中心比对编码CAMP 蛋白序列、标本中基因序列，阳性标准为都有B 族链球菌特有的基因序列。

细菌培养检测：在5%羊血培养基中接种阴道分泌物标本、直肠分泌物标本，分区、划线，放在5%～10%二氧化碳培养箱中，培养箱温度设置为35℃。实施持续24 h 的培养，按照菌落形态以及溶血情况，对可疑菌落进行涂片染色，借助显微镜进行观察。 接着实施菌种鉴定，需要进行的试验类型包括杆菌肽试验、溶血试验、七叶苷试验、胆汁溶解试验、触酶试验、马尿酸钠水解试验、CAMP 试验。

荧光PCR 检测：先处理标本，将1 mL 灭菌生理盐水加入无菌拭子管中， 高速进行10 min 的震荡， 将拭子挤干，向试管移放标本悬液，在13 000 r/min 的速度下进行持续10 分钟的离心处理，去除上清液后，将1 mL 灭菌生理盐水加入剩下的沉淀物中，继续在13 000 r/min 的速度下进行持续10 min 的离心处理，再次去除上清液。取沉淀物加入DNA 提取液，提取液主要成分为Tris-HCl、NaOH、Triton、EDTA，混匀，置99～100℃加热10 min。 13 000RPM离心10 min。 PCR 反应液的主要成分为Taq 酶、UNG 酶、引物、探针、dNTP，取35 μL 至反应管，在PCR 反应管中加入样本上清5 μL。 实施PCR 扩增，UNG 反应，50℃2 分钟； 预变性，95℃5 min；PCR，95℃15 s，45 个循环；60℃时分别检测FAM 和HEX 通道荧光信号，选择反应体系40 μL。空白及阳性对照品提取同步。

1.3 统计方法

数据通过SPSS 22.0 统计学软件分析，计数资料表示为[n(%)]，经χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实时荧光PCR、基因测序法比较

以基因测序法为金标准，实时荧光PCR 对于GBS 筛查的灵敏度为97.62%， 特异度为99.68%， 准确度为99.55%，阳性预测值为95.35%，阴性预测值为99.84%，见表1。

表1 实时荧光PCR、基因测序法对于GBS 检出情况比较（n）

2.2 实时荧光PCR、细菌培养法比较

实时荧光PCR 检出GBS 阳性率为6.41%， 细菌培养法检出GBS 阳性率为5.37%，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 实时荧光PCR、细菌培养法检出GBS 阳性率比较

3 讨论

早期细菌培养法是筛查GBS 感染的重要方法， 还包括培养后菌落的协同凝集试验、胶乳凝集试验，对于GBS的判定主要是通过观察溶血性、菌落特点，并通过显微镜进行形态观察，以及结合生化试验结果[6-7]。 不过这种检测需要花费1～2 d 时间才能得到结果， 同时操作上比较繁琐，直肠、阴道部位的细菌还会对GBS 的繁殖形成抑制，培养存在比较明显的难度， 并且对于大样本筛查要求的快速性无法满足，检测阳性率无法保证[8-9]。 该组通过细菌培养，阳性率仅为5.37%，不足实时荧光PCR 检出的阳性率6.41%， 也明显低于基因测序法检出的阳性率6.26%（χ2=6.590，P＜0.05）。 与杨洁等[10]研究显示的细菌培养检出阳性率3.4%比较也有一定差异。

当前荧光PCR 检测在临床得到越来越广泛的应用，通过不同种属GBS 的特异性核酸序列进行引物的设计，借助荧光探针进行标记，通过先进PCR 检测仪器的应用，能够在2～3 h 之内获得检测结果， 适用于大样本的筛查，且结果灵敏度较高[11-12]。 该研究6 710 例孕妇经实时荧光PCR 筛查显示灵敏度为97.62%，特异度为99.68%，准确度为99.55%， 阳性预测值为95.35%， 阴性预测值为99.84%。 杜淑娴等[13]研究显示，PCR 法筛查GBS 感染的灵敏度为80.9%，特异性为99.1%，其中特异度结果与该研究具有一致性， 但灵敏度结果明显更低， 考虑为研究对象、检测操作、技术水平差异引起。

相比之下，实时荧光PCR 技术对于GBS 感染筛查的阳性率要高于细菌培养，其中一个原因是采集标本后，受到环境温度、保存条件等各个因素的影响，GBS 部分可能出现死亡，这种情况下细菌培养会显示为阴性结果，但荧光PCR 法可以将死亡后的GBS 检测出来。 相关指南指出，最高接近2/5 的GBS 会传递给新生儿，其中接近3%的新生儿会出现GBS 感染，5%的新生儿会直接死亡[14]，所以做好GBS 感染筛查，及时发现孕妇GBS 感染，能够指导临床尽早治疗干预，减少甚至避免向新生儿传递，提升生育质量。

综上所述， 实时荧光PCR 技术检测妊娠晚期孕妇B族链球菌感染准确度、灵敏度及特异度均较高，有助于指导临床积极采取干预措施，控制GBS 感染，减少对分娩的影响。