王丹丹，陈子乾，王 星

(辽东学院 农学院，辽宁丹东 118003)

红光熊蜂(BombusignitesSmith)隶属于膜翅目(Hymenoptera)蜜蜂科(Apidae)熊蜂属(Bombus)，是一类重要的本土传粉昆虫，分布在黑龙江、辽宁、甘肃、河北、山西和云南等地，其在保持生物多样性及维持生态系统平衡方面尤为重要[1]。熊蜂吻喙长，访花过程中接触柱头频率较高，对低温、弱光、高湿环境的适应力显著高于蜜蜂，能抵抗恶劣环境、日工作时间及单花访问时间较长，且熊蜂没有蜜蜂敏锐的信息交流系统，可专心于温室作物授粉，不仅能提高坐果率和产量，改善果实籽粒品质，亦可避免使用植物生长调节剂处理花朵带来的激素污染。所以，熊蜂是温室作物尤其是茄科植物的理想授粉者[2]。

化学感受器是熊蜂与外界环境及其他个体交流的关键，对昆虫的社会行为至关重要，可介导个体对周围环境中化学信号的检测，嗅觉可使器官识别环境中的不同气味，寻找食物、配偶、生存与繁殖场所以及辨别食物、同伴与天敌，躲避外界环境的伤害[3-5]。味觉可辨别可溶性激素，激发先天交配行为；参与化学信号识别的重要蛋白包括各种不同大小的基因家族，其中化学感受器受体超家族至关重要，由气味受体(odorant receptors, ORs)、味觉受体(gustatory receptors, GRs)以及离子受体(ionotropic receptors, IRs)共同构成，其中ORs是嗅觉识别过程中的关键成分之一。昆虫的气味受体包括普通气味受体(ORs)与气味共受体(Orco)两类。ORs在不同昆虫中是高度分化的，而昆虫的Orco只有一种且高度保守[6-9]。

本试验以红光熊蜂为研究对象，采用扫描电镜对红光熊蜂触角感受器进行观察；以RT-PCR技术获得BiOr119的cDNA序列，克隆气味受体基因BiOr119，采用多种生物信息学软件预测其氨基酸结构、蛋白质特性，构建氨基酸同源性系统进化树；采用实时定量PCR技术分析红光熊蜂气味受体基因BiOr119在工蜂不同发育阶段、不同组织中的表达情况，推测BiOr119在红光熊蜂嗅觉识别过程中发挥的重要作用，为进一步研究红光熊蜂气味受体基因的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用红光熊蜂为辽东学院农学院蜜蜂研究所繁育，饲养温度28 ℃±0.5 ℃，湿度50%±5%，无光照。取繁育旺盛，健康无病蜂群中的红光熊蜂工蜂作为试验材料，刚羽化出蜂房的工蜂标记为1日龄，而后每5 d用无毒无味的油漆标记1次，随后分别在1、5、10、15、20、25、30日龄采样，每次每群各取30头，标记后放入蜂群中[10-11]。

1.2 触角感受器电镜扫描

将红光熊蜂触角取下浸泡在φ=2.5%戊二醛中固定24 h，超声波清理触角后，置于碘化钾组织导电液中8 h，用蒸馏水清洗后，采用叔丁醇脱水、干燥[12]，以备日立S4800型场发射扫描电镜拍照观察。

1.3 总RNA提取

采样各日龄红光熊蜂30头带回实验室分离各组织，低温麻醉后用眼科镊剥离其完整触角、头(去除触角)、胸、腹、足和翅，迅速放入盛有液氮的研钵中，研磨至粉末状倒入RNA-free的1.5 mL Trizol(4 ℃)EP管中，-80 ℃保存，以备RNA提取[13]。试验于2018年5-6月于辽东学院农学院基因工程实验室进行，此时为自然界蜜粉源充足时期。

按照Takara公司总RNA微量提取试剂盒操作步骤提取工蜂各组织总RNA，并检测RNA完整性。按照反转录试剂盒PrimeScriptTMRT Master Mix perfect Real Time，以总RNA为模板，Oligo-dT为引物，合成第一链cDNA，-20 ℃保存，备用。上述药品均购于上海生工生物工程股份有限公司。

1.4 引物设计

根据GenBank上已报道的地熊蜂(Bombusterrestris)的气味受体基因BtOr9a(登录号：NC_015772.1)设计特异性克隆引物(premier 5.0)[14]，用于扩增红光熊蜂气味受体基因，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成(表1)，采用DANMAN、ClustalW、BlastP等在线软件找出开放阅读框(ORF)区域，并设计特异性引物用于荧光定量qPCR，熊蜂β-actin为内参基因 (表1)。

表1 引物信息Table 1 The information of primers

1.5 红光熊蜂气味受体基因 BiOr119克隆与测序

以逆转录cDNA为模板进行PCR反应，反应体系为20 μL：ddH2O 14 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 1.5 μL，200 U/mLTaqDNA polymerase 0.5 μL，10 μmol/L上下游引物各 1 μL，cDNA模板 2 μL； PCR反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，59 ℃退火50 s，72 ℃延伸3 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物于4 ℃保存[15-16]。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的条带、双向测序(上海生工生物工程股份有限公司)。

1.6 生物信息学分析

采用DNAStar软件中的SepMan对红光熊蜂基因BiOr119序列进行拼接，获得BiOr119的cDNA序列；采用在线软件ORF Finder 搜索该序列的开放阅读框(ORF)，DNAMAN软件预测其氨基酸序列，使用NCBI中BlastP进行氨基酸同源序列分析；采用MEGA7.0软件邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树[17]。

1.7 红光熊蜂 BiOr119基因表达量分析

1.8 重复性试验

以不同日龄工蜂各组织cDNA为模板，qPCR分析BiOr119各组织差异表达量，分别取3份样品，在同等条件下扩增，每份样品平均做3个平行试验，作为生物学重复，分析其组内及组间差异，以检测该荧光定量qPCR方法的重复性及稳定性[19]。

1.9 统计学分析

采用MxPro Excel比较红光熊蜂BiOr119在工蜂羽化后的不同组织、不同发育阶段的相对表达量；以SPSS 19.0软件中单因素ANOVA方法进行方差分析[20]。

2 结果与分析

2.1 红光熊蜂触角感受器电镜图

经扫描电镜观察红光熊蜂工蜂触角感受器(图1)，可见工蜂触角上具4种感受器，构成熊蜂主要的嗅觉器官，以板型感受器和刺状感受器为主，仍具毛状感受器和腔型感受器；板型感受器呈椭圆形的盘状结构，表面具数个大小不一的突起，在工蜂触角上分布紧密，覆盖在鞭节表面，板型感受器周围遍布锥状感受器，短粗的钉状，着生于臼状窝内；毛型感受器顶端略弯，基部从触角表皮上的鞘状结构延伸出来，向顶端生长；腔型感受器在触角上分布较少，由表皮向内凹陷形成，且凹陷区中间有不规则的锯齿结构。

2.2 红光熊蜂 BiOr119基因的克隆与测序

采用DNAstar软件中的SeqMan程序拼接克隆的特异性产物，搜索该基因完整的ORF，得到BiOr119基因序列长度为1077bp，共编码358个氨基酸(图2)。NCBI保守结构域在线分析表明，BiOr119基因编码的氨基酸在28～339位具有一个昆虫气味受体家族的保守结构域7tm-6 superfamily(E-value：2.45e-07)，蛋白具有6个跨膜结构域，分别位于52～81、106～139、 154～180、216～239、262～282、318～348位氨基酸之间、且蛋白氨基端位于膜内(图3)。

A. 熊蜂触角背面观(30 μm) The dorsal view ofBombusignitesantenna (30 μm)； B.熊蜂触角腹面观(30 μm) The ventral view ofBombusignitesantenna (30 μm) ；C. 熊蜂触角背面观(10 μm) The dorsal view ofBombusignitesantenna (10 μm)；D. 熊蜂触角腹面观(10 μm) The ventral view ofBombusignitesantenna (10 μm)；1.板型感受器 Sensilla coeloconica；2.锥状感受器 Sensilla basiconica；3.毛状感受器 Sensilla trichodea；4.腔型感受器 Sensilla basiconica

图1 红光熊蜂触角感受器扫描电镜图照片
Fig.1 The SEM photos of antennal sensilla ofBombusignites

基因序列长度为1 077 bp，最大开放阅读框共编码358个氨基酸(1 074 bp)分子质量为41.413 ku；6个跨膜结构域为红色下划线标注 The length of the gene sequence is 1 077 bp, the maximum open reading frame encodes a total of 358 amino acids (1 074 bp) with a molecular mass of 41.413 ku; the six transmembrane domains were underlined in red.

图2 红光熊蜂BiOr119基因cDNA核苷酸序列及其翻译的氨基酸序列
Fig.2 Nucleartide and translated amino acid sequences ofBiOr119cDNA ofBombusignites

图3 红光熊蜂 BiOr119基因预测的蛋白跨膜结构域Fig.3 Prediction of transmembrane structure of BiOr119 of Bombus ignites

2.3 红光熊蜂 BiOr119基因结构与理化分析

采用ProtParam(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)预测BiOr119蛋白质分子式C1906H2965N459O521S26，分子质量为41.48 ku，理论等电点(pI)7.04，偏碱性；在BiOr119蛋白质的氨基酸组成中苯丙氨酸(Ile)所占比例最高 11.5%，色氨酸(Trp)最低1.4%；带正电荷的氨基酸残基(Arg + Lys)与带负电荷的氨基酸残基(Asp + Glu)均为32，说明该蛋白不带电。BiOr119蛋白质的平均亲水系数0.347，不稳定性指数39.98，脂溶性指数111.84，表明BiOr119是一种稳定的疏水性蛋白。

2.4 红光熊蜂BiOr119聚类分析

在NCBI数据库中将BiOr119预测的氨基酸序列进行BlastP比对分析，得到与BiOr119序列一致性较高的地熊蜂BtOr9a(96.2%)，其他与BiOr119具有同源性的氨基酸序列分别为膜翅目蚁属、蜜蜂属和熊蜂属，氨基酸序列同源性为35%～85%，采用MEGA7.0软件邻接法构建系统发育树(图4)，共分为3支，第1支为蚁属红色收获蚁；第2支为中华蜜蜂Apisceranacerana、西方蜜蜂Apismellifera和大蜜蜂Apisdorsata；第3支为兰州熊蜂Bombuslantschouensis、地熊蜂Bombusterrestris和红光熊蜂Bombusignites。

2.5 红光熊蜂 BiOr119基因的相对表达量分析

采用qPCR技术分析红光熊蜂工蜂1、5、10、15、20、25和30日龄不同组织中BiOr119基因的表达量，以10日龄工蜂头部BiOr119基因表达量为相对基准量。结果显示(图5)，BiOr119基因的表达量随日龄变化在不同组织中差异较为显著，触角中BiOr119基因的表达量在各日龄工蜂中最高，并极显著高于其他各组织(P<0.01)，BiOr119基因在1日龄触角中的表达量较低，随后缓慢增加，至15日龄骤然下降，后回升至25日龄时达到峰值，随后趋于下降趋势；而在腹部的表达量最低，约为相应日龄工蜂触角表达量的 299～759倍，可见，触角在红光熊蜂嗅觉识别过程中起着主要作用，是其较为重要的嗅觉器官。

蛋白质：PbrOr9a-like：红色收获蚁Pogonomyrmexbarbatus，XP_011643586.1；AcerOr113：中华蜜蜂Apisceranacerana，ALP_75639.1；AmelOr109：西方蜜蜂Apismellifera，NP_001229917.1；AdorOr1-like：大蜜蜂Apisdorsata，XP_006608961.1；BlOr162：兰州熊蜂Bombuslantschouensis，KX_270974.1；BlOr66：兰州熊蜂Bombuslantschouensis，MK_061344.1；BtOr9a：地熊蜂Bombusterrestris，NC_015772.1； BiOr119：红光熊蜂Bombusignites；BtOr22c：地熊蜂Bombusterrestris，XM_012312228.1；BtOr13a：地熊蜂Bombusterrestris，XM_0123091122

Amino acid:PbrOr9a-likePogonomyrmexbarbatus，XP_011643586.1; AcerOr113Apisceranacerana, ALP_75639.1; AmelOr109:Apismellifera, NP_001229917.1; AdorOr1-like:Apisdorsata, XP_006608961.1; BlOr162:Bombuslantschouensis, KX_270974.1; BlOr66:Bombuslantschouensis, MK_061344.1; BtOr9a:Bombusterrestris, NC_015772.1;BiOr119:Bombusignites; BtOr22c:Bombusterrestris, XM_012312228.1; BtOr13a:Bombusterrestris, XM_0123091122

图4 基于BiOr119氨基酸序列构建的Ors基因系统进化树(邻接法)
Fig.4 Phylogenetic tree of Ors based on amino acid sequences of BiOr119 with neighbor-joining method

3 讨 论

嗅觉是熊蜂对周围环境中挥发性物质的感受过程。熊蜂触角含有大量嗅觉感受器，对其觅食、求偶、繁殖、躲避敌害等行为尤为重要。熊蜂对外界气味分子的识别是一个非常复杂的过程，有多种蛋白参与，即气味结合蛋白(odorant binding protein, OBPs)、气味受体、化学感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)、感觉神经元膜蛋白(Sensory neuron membrane protein, SNMPs)以及气味降解酶(odorant degrading enzymes, ODEs)等[21]。每个嗅觉感受器内均含有多条嗅觉感受神经元，外界气味分子先与气味结合蛋白形成复合体，后穿过淋巴液到达气味受体，气味受体受到刺激产生动作电位形成嗅觉信号，嗅觉信号通过嗅觉神经元传递到脑部的触角叶结构，最终获得气味分子的抽象信息，从而指导昆虫的各种行为。气味受体(Ors)是熊蜂嗅觉生理过程中重要的参与者，大部分Ors具有典型的结构7tm-6 superfamily，即：7次跨膜结构域的受体蛋白，其气味受体蛋白的N端在细胞膜内，C端在细胞外，这点与脊椎动物嗅觉受体的G蛋白偶联受体不同，该受体具有感知和传输气味的功能，红光熊蜂 BiOr119蛋白质呈碱性，不带电，为仅具6个跨膜结构域疏水性蛋白，与小菜蛾PxylOr18[22]，中华蜜蜂AcerOr1和AcerOr3推测的结果一致[23]；此外，通过NCBI氨基酸序列同源性比对分析，显示BiOr119与膜翅目熊蜂属及蜜蜂属部分昆虫的气味受体具有较高的同源性，与地熊蜂BtOr9a同源性高达96.2%，推测可能是由同一基因分化而来，而与蚁属或膜翅目其他属则表现出较低的同源性，说明不同种类的昆虫，由于对不同气味分子的信息素感知具有专一性，而导致其气味受体基因具有高度的变异。综上所述，红光熊蜂BiOr119符合昆虫气味受体结构特征。

基因表达量以10日龄红光熊蜂工蜂头部的表达量为基准；图中数据表示同一日龄工蜂不同组织间BiOr119的表达量(平均值±标准误)。“**”表示差异极显著(P<0.01)，“*”表示差异显著(P<0.05)

The expression level of gene was normalized to that in the head of workers of 10-day-old.the data was expression level ofBiOr119in different day-old and different tissues ofBombusignites(mean±SE ).“**”the difference was statistically very significant (P<0.01) , “*”the difference was statistically significant (P<0.05)

图5BiOr119基因在工蜂不同日龄、不同组织中的相对表达量
Fig.5 Relative expression level ofBiOr119in different day-old and different tissues ofBombusignites

红光熊蜂是一种典型的社会性昆虫，各群体分工明确，根据工蜂生理日龄分别承担蜂巢内外的工作，在18日龄以前为内勤蜂，在巢内保温孵卵、蜜蜡造脾、饲喂幼虫和蜂王及清理蜂房，18日龄以后工蜂日渐成熟，逐渐转向巢外采集花粉、树胶和水等。本试验结果表明，红光熊蜂BiOr119基因的表达量在15日骤降，推测15日龄为内勤蜂转为采集蜂的过渡阶段，受到巢内外环境、激素水平、脑部化学物质及基因表达等诸多因素的影响，导致该气味受体表达量较低，在25日龄后表达量有下降趋势，可能是由于采集蜂工作10 d以上，其空间记忆、联想学习能力明显衰退，并伴随着脑部蛋白质与脂类的氧化损伤、突触和生长相关蛋白神经元的减退，死亡率增加[24-26]。