王爱萍，陈 冰，刘红亮，周景明，陈玉梅，刘燕凯，祁艳华，张改平

(郑州大学 生命科学学院，郑州 450000)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一类严重危害养猪业的高度接触性传染病[1]。PRRSV是单股正链RNA病毒，属于套式病毒目 (Nidovirales)，动脉炎病毒科 (Arterividae)[2]。PRRSV分为两种基因型：欧洲型(基因Ⅰ型)和北美洲型(基因Ⅱ型)[3]。

PRRSV的基因组大小约15kb，包含至少12个开放阅读框 (Open reading frames,ORFs)，分别编码不同的病毒蛋白[4]。由ORF4编码的GP4蛋白参与病毒的转运，在病毒复制中起重要作用[5]。GP4与GP2a、GP2b、GP3可形成异源多聚体，在病毒感染中发挥关键作用[6-7]。有研究报道，GP4与GP2、GP3和GP5相互作用，与CD163受体相识别，介导PRRSV侵染宿主细胞[8]。

PRRSV感染机体后，引发体液免疫应答，从而产生多种特异性抗体，有助于避免机体再次感染。有研究证明，中和抗体在抗PRRSV感染中起重要作用[9-10]，相关中和表位已有报道。本研究通过合成PRRSV GP4蛋白的重叠多肽，经多肽ELISA筛选GP4蛋白的B细胞表位，旨在深入了解和研究GP4蛋白的B细胞表位，为PRRSV的抗体检测及其表位疫苗的研究提供 帮助。

1 材料与方法

1.1 试验动物血清

PRRSV阴性血清及JXA1-R毒株免疫的PRRSV阳性血清由郑州大学生命科学学院动物分子免疫实验室保存。

1.2 GP4重叠多肽的设计

根据GenBank数据库中发表的PRRSV GP4蛋白序列(GenBank:ACN 93856.1)，设计合成17条重叠多肽，每条多肽长18个氨基酸，相邻肽段重叠9个氨基酸残基。覆盖了除去N端信号肽序列(前22个氨基酸)的完整的GP4蛋白，送由上海吉尔生化有限公司进行合成，将重叠多肽分别命名为GP4-1～GP4-17。

1.3 间接ELISA

将1 mg多肽干粉溶于50 μL 二甲基亚砜(DMSO)中，每管5 μL分装，冻存于-80 ℃ 冰箱。

用碳酸盐缓冲溶液(CBS)将多肽稀释至10 ng/μL，每孔100 μL作为包被抗原，设立3个平行对照，PRRSV N蛋白作为阳性对照。在用50 g/L脱脂奶进行封闭后，将PRRSV阴性血清和阳性血清按照1∶100的比例稀释作为一抗，HRP标记的羊抗猪IgG(Goat anti-Swine IgG/HRP)以 1∶5 000的比例稀释作为二抗，最后避光显色 5 min后终止，测定OD450 nm值。

1.4 Dot-ELISA

将条状硝酸纤维素膜(NC膜)在磷酸盐缓冲液(PBS)中完全浸湿，室温风干。将多肽用PBS稀释至2 μg/μL，取1 μL点在膜上，干燥，PRRSV N蛋白作为阳性对照。用50 g/L脱脂奶封闭2 h后，以1∶100稀释的PRRSV阴性血清和PRRSV阳性血清为一抗，二抗是以 1∶5 000的比例稀释后的HRP标记的羊抗猪IgG，最后化学发光法显示试验结果。

1.5 抗免疫显性肽段抗体水平的测定

将筛选得到的免疫显性多肽用CBS稀释至10 ng/μL，100μL/孔作为包被抗原，设立3个平行对照，并以不相关多肽作为阴性对照。封闭液为50 g/L脱脂奶，试验猪免疫前的阴性血清和免疫后每周采血分离得到的阳性血清以1∶100的比例稀释作为一抗，1∶5 000稀释的HRP标记的羊抗猪IgG作为二抗，最后避光显色5 min，终止后测定OD450 nm值。

2 结果与分析

2.1 GP4蛋白重叠多肽的合成

最终成功合成13条重叠多肽(表1)，GP4-11、GP4-12、GP4-16、GP4-17号重叠多肽未成功合成。合成的多肽纯度均能达到95%以上，满足后续的试验要求。

表1 重叠多肽的合成Table 1 Synthesis of overlapping peptides

2.2 ELISA筛选GP4蛋白免疫显性肽段

以13条重叠多肽作为包被抗原，通过间接ELISA的方法对多肽与血清间的反应进行测定，ELISA结果如图1所示。图1中GP4-1、GP4-2、GP4-4和GP4-5号肽段与阳性血清产生反应，将具有阳性反应的结果汇总为图2，以便观察并分析结果。从图2可知，GP4-1号肽与9411、9437号试验猪的血清有较弱的阳性反应；GP4-2号肽与9400、9411、9427、9464号试验猪的血清有较弱的阳性反应；GP4-4号肽与5头试验猪的血清均有较强的阳性反应；GP4-5号肽与5头试验猪的血清均有较弱的阳性反应，其余肽段与阳性血清样品均没有反应。

图1中A、B、C、D、E图分别对应编号为9400、9411、9427、9437、9464试验猪的试验结果。纵坐标为OD450nm值，横坐标为多肽编号，PC为阳性对照(PRRSV N蛋白)。浅色矩形代表免疫前，深色矩形代表免疫后12周。

图2中A、B、C、D分别代表GP4-1、GP4-2、GP4-4、GP4-5号肽段与5头试验猪PRRSV阴性和阳性血清的反应结果，纵坐标为OD450nm值，横坐标为试验猪编号，浅色矩形代表免疫前，深色矩形代表免疫后12周。

2.3 Dot-ELISA方法筛选GP4蛋白免疫显性肽段

以13条重叠多肽作为抗原，通过Dot-ELISA的方法进行筛选，结果如图3所示。GP4-4号肽段与5头试验猪的血清样品均有明显的阳性反应；GP4-1号肽与9437号猪的阳性血清有较弱的阳性反应；GP4-2号肽与9400号猪的阳性血清有较弱的阳性反应；其余多肽与5头试验猪的血清样品均没有阳性反应。Dot-ELISA与间接ELISA的结果基本一致，筛选出1个GP4蛋白B细胞免疫显性肽段GP4-4：Ⅰ(50) SCLRHGDSSSPTIRKSS (67)。

图3中，GP4-1～15为肽段编号，N代表PRRSV N蛋白，9400、9411、9427、9437、9464为试验猪编号，PC代表免疫后12周的结果，NC代表免疫前的结果。

2.4 抗GP4-4号肽段的抗体水平

以筛选出来的免疫显性多肽GP4-4作为包被抗原，测定其抗体水平，结果如图4所示。抗GP4-4号肽段的抗体可在免疫后3～5周被检测到，之后呈现为较均匀的稳步上升。

图4中，9400、9411、9427、9437、9464为试验猪编号。纵坐标为OD450nm值，横坐标为免疫周数，NC为阴性对照(不相关多肽)。

A、B、C、D、E分别对应编号为9400、9411、9427、9437、9464参试猪的试验结果 A,B,C,D,and E correspond to the experimental results of pigs numbered 9400,9411,9427,9437,and 9464,respectively

图1 ELISA方法筛选PRRSV GP4蛋白免疫显性肽段
Fig.1 Screening immunodominant peptides of PRRSV GP4 protein by ELISA method

A、B、C、D分别代表GP4-1、GP4-2、GP4-4、GP4-5号肽段与5头参试猪PRRSV阴性和阳性血清的反应结果 A,B,C,and D represent the results of the reaction of the GP4-1,GP4-2,GP4-4,and GP4-5 peptides with the PRRSV-negative serum and the positive serum of the five experimental pigs,respectively

图2 ELISA方法筛选PRRSV GP4蛋白免疫显性肽段
Fig.2 Screen immunodominant peptides of PRRSV GP4 protein by ELISA method

图3 Dot-ELISA方法筛选PRRSV GP4蛋白免疫显性肽段Fig.3 Screening immunodominant peptides of PRRSV GP4 protein by Dot-ELISA method

图4 ELISA方法检测针对GP4-4号多肽的抗体的消长规律Fig.4 The growth and decline of antibodies against GP4-4 polypeptide detected by ELISA method

3 讨 论

本研究在设计GP4蛋白的重叠多肽时，考虑到信号肽的主要功能是帮助蛋白跨膜定位，因此将GP4蛋白的信号肽区域截取掉，只对23～178 位氨基酸进行多肽设计与合成。另外，已知B细胞表位的大小一般为5～15个氨基酸残基，为尽量避免表位筛选遗漏，本试验在设计重叠多肽时，将每段多肽的残基数定为18个，相邻肽段重叠9个氨基酸残基。

本研究通过合成PRRSV GP4蛋白的重叠多肽，经多肽ELISA对PRRSV JXA1-R毒株GP4蛋白的重叠多肽进行筛选，结果显示GP4-4号肽段与所有试验猪阳性血清均有较强阳性反应；GP4-1、GP4-2号肽段并不是与所有的试验猪阳性血清都产生反应，且反应较弱，存在个体差异；另外，GP4-5号肽段与所有试验猪阳性血清均有较弱的阳性反应，这可能是由于GP4-5号肽段与GP4-4号肽段存在9个氨基酸残基重叠的原因。Dot-ELISA结果也显示GP4-4号肽段与所有试验猪阳性血清均有较强阳性反应，与间接ELISA的结果一致。初步筛选得到的GP4-4号肽段(50～67 aa)与Meulenberg等[11]和De Lima等[12]筛选的B细胞表位存在较大的重叠区域，验证了前人结果的同时也说明该肽段为优势肽段。GP4-4号肽段(50～67 aa)还包含中和表位核心区域51～65 aa或59～67 aa[11-13]，具有很大的研究价值。

在本研究中，抗GP4-4号肽段的抗体可在免疫后3～5周被检测到，该肽段包含中和表位，并且已知针对PRRSV GP4蛋白的中和抗体可在猪感染PRRSV后20 d左右时被检测到[14]，本研究的结果与已有报道基本一致。研究表明，中和抗体在抗PRRSV感染中起关键作用[9-10]。血清中的中和抗体可以保护高危易感群体，包括怀孕母猪和仔猪。因此，在对猪进行PRRSV疫苗免疫后，可检测机体内是否产生针对GP4蛋白B细胞中和表位的抗体，来判断机体是否产生中和抗体，从而评估疫苗是否对机体产生了保护作用。

总之，对PRRSV GP4蛋白B细胞表位的研究不仅能够用于PRRSV的抗体检测，还对PRRSV表位疫苗的研究有所帮助，表位疫苗则是未来疫苗的发展方向。