权桂蓉，惠竹梅,

(1.西北农林科技大学 葡萄酒学院，陕西杨凌 712100；2.陕西省葡萄与葡萄酒工程中心，陕西杨凌 712100)

糖类是果实生长发育的物质基础，是果实品质成分和风味物质等合成的基础原料；糖还作为信号分子，与激素、N等信号联成网络，通过复杂的信号转导机制调节植物生长发育与基因表达[1-2]。葡萄果实中的可溶性糖主要包括葡萄糖和果糖，蔗糖的质量分数很少，糖类物质的代谢及其变化决定了成熟葡萄果实中的糖类组成和质量分数。葡萄叶片作为源组织通过光合作用合成糖类物质，糖类物质以蔗糖的形式经过韧皮部长距离运输至库组织——葡萄浆果中，蔗糖的运输主要依靠蔗糖转运蛋白(sucrose transporter，SUT)[3]。随后蔗糖在转化酶的作用下水解成葡萄糖和果糖后运输进入中果皮细胞的液泡中储存，糖分积累主要受糖代谢关键酶，包括转化酶(Invertase，Ivr)、蔗糖合成酶(Sucrose synthase，SS)和蔗糖磷酸合成酶(Sucrose phosphate，SPS)的调控[4]。糖分进入液泡积累须跨越质膜和液泡膜，位于膜上的糖运输蛋白在介导糖向韧皮部装载、从韧皮部卸出及运输进入果实细胞和液泡中贮藏和代谢等决定光合产物分配的跨膜运输进程中起重要作用[5]。现已从葡萄果实中鉴定出6个单糖运输蛋白cDNA、VvHT1-6、以及3个蔗糖运输蛋白cDNA、VvSUC11、VvSUC12和VvSUC27[6-7]。

Zhang等[8]研究表明，在葡萄果实发育过程中，前期可溶性糖的积累很慢，果实韧皮部卸载方式为共质体卸载；进入转色期以后，大量的糖转运到葡萄浆果果皮细胞，己糖开始迅速积累，果实韧皮部卸载转化为质外体卸载。葡萄果实在转熟之前，己糖主要用于代谢；转熟之后，己糖主要用于积累；果实中糖的积累首先取决于浆果内在遗传特性[9]。

尽管已有研究表明酸性转化酶、蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶和糖转运蛋白与葡萄果实糖积累有关，但由于葡萄品种间的差异，‘西拉’葡萄果实糖积累的分子机制还不清楚。‘西拉’葡萄果实发育过程中可溶性糖的积累与糖代谢有关的基因表达量关系的研究尚未见报道。因此，本研究通过设计实时荧光定量PCR引物，研究‘西拉’葡萄进入转色期以后，与糖代谢相关的15个基因和可溶性糖在葡萄果实发育过程中的变化规律，为揭示‘西拉’葡萄果实中可溶性糖代谢与积累的分子机制和葡萄果实品质的调控机制奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2017年7月13日-8月30日在山西省襄汾县尧京酒庄(111.57°E，35.92°N)进行，该地区属半干旱、半湿润季风气候区，年均气温为9.0～12.9 ℃，全年日照数平均为1 748～2 513 h，无霜期为127～280 d，年均降水量为420.1～550.6 mm。试材为‘西拉’(Syrah)葡萄，植株定植于2012年，东西行向栽培，株行距为1 m× 3 m，斜拉“厂”字形单篱架，半机械化管理，冬季埋土防寒。

1.2 试验设计

2017年7月13日‘西拉’葡萄进入转色期进行第1次采样，直至果实成熟共采样5次(分别对应花后57 d、64 d、71 d、85 d、100 d)。“Z”字形采样，南北方向兼顾，采用穗采方式，6穗为1个重复，设置3个重复。再采用粒采的方式，兼顾每穗葡萄的各部位采集葡萄80粒，放于液氮中速冻，随后储存于-80 ℃冰箱中，用于表达量的测定。其余果实置于-20 ℃冰箱中储存，用于生理指标的测定。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 还原糖和总酸质量浓度 用斐林试剂滴定法测定还原糖质量浓度，结果以葡萄糖计；用氢氧化钠直接滴定法测定总酸质量浓度，结果以酒石酸计。

1.3.2 果皮酚类物质质量分数 酚类物质的提取采用Di等[10]的方法并稍做修改。分离果皮，擦干并称量，放入50 mL离心管中，加入30 mL提取液(体积分数12%乙醇，600 mg/L焦亚硫酸钠，5 g/L酒石酸，蒸馏水，用1 mol/L NaOH调节pH至3.20)。在25 ℃摇床中避光提取3 d，分离上清液并记录体积为30 mL， -20 ℃避光保存，以备总花色苷、单宁和总酚的测定。

总酚的测定按照福林酚法Folin-Ciocalteus[11]进行，结果以没食子酸表示(mg/g)；花色苷的测定采用pH示差法[12]，以锦葵色素-3-葡萄糖苷(CGE，mg/L)表示；单宁用蛋白质沉淀法测定[11-12]，以儿茶素计(mg/g)。

1.3.3 可溶性糖质量分数的测定 可溶性糖的提取参照徐凡等[15]的方法并加以改进，取果实加液氮研磨后称取3 g，加入6 mL 80%的乙醇， 35 ℃下提取20 min，6 500 r/min下离心15 min，取上清液。重复提取3次，合并上清液，定容至20 mL。取1 mL于旋转蒸发仪蒸干(35 ℃)后，用1 mL重蒸水溶解，0.22 μm水系滤头过滤后，采用岛津LC-30A超高效液相色谱进行测定。色谱条件：色谱柱为ZORBAX Carbohydrate(4.6 150 mm，5 μm)；流动相为乙腈∶水=80∶20(体积比)；流速1.2 mL/min；进样量20 L；柱温 40 ℃；示差折光检测器。试验所用葡萄糖和果糖标准品购自Sigma公司。

1.4 数据处理

使用Excel 2016对试验数据进行整理和计算，使用SPSS 20.0软件进行方差及显著性分析，使用Origin 2016软件绘图。所有指标均重复测定3次，取平均值。

2 结果与分析

2.1 ‘西拉’葡萄果实生长发育过程中糖酸质量浓度的变化

‘西拉’葡萄生长发育过程中还原糖及总酸质量浓度的变化见图1。还原糖质量浓度在果实成熟的整个阶段整体呈现先升高后趋于稳定的趋势。随着果实的成熟可滴定酸的质量浓度快速降低，随后趋于稳定。成熟期可滴定酸的质量浓度为5.2 g/L。

表1 实时荧光定量PCR引物序列Table 1 Primers of real-time quantitative PCR

图1 ‘西拉’葡萄果实发育过程中糖酸质量浓度Fig.1 Sugar and total acid during‘Syrah’ grapes development

2.2 ‘西拉’葡萄果实生长发育过程中葡萄果皮总酚、单宁和花色苷质量分数的变化

酚类物质是反映葡萄果实品质和葡萄酒质量的重要次级代谢产物。图2显示，总酚质量分数在花后57～64 d有所降低，花后64～71 d缓慢上升，花后71～85 d迅速上升，随后又迅速降低。单宁的质量分数在花后57～64 d较稳定，花后 63～100 d呈下降的趋势。总花色苷在花后57～64 d的积累较慢，在花后64～71 d快速积累，随后保持稳定。

图2 ‘西拉’葡萄果实发育过程中的总酚、单宁和花色苷质量分数Fig.2 Mass fraction of total phenol, tannin and anthocyanin during ‘Syrah’ grapes development

2.3 ‘西拉’葡萄果实生长发育过程中果实可溶性糖质量浓度的变化

‘西拉’葡萄果实发育过程中葡萄糖和果糖质量浓度的变化如图3所示。葡萄糖和果糖质量浓度整体呈增加的趋势。葡萄糖的质量浓度在花后57～71 d迅速升高，在花后71～100 d趋于稳定。果糖质量浓度的变化趋势与葡萄糖一致。葡萄糖质量浓度在果实发育的各个时期均大于果糖。

2.4 ‘西拉’葡萄果实生长发育过程中果实糖代谢相关基因表达水平的变化

对‘西拉’葡萄果实中15个基因表达量进行检测，包括5个单糖运输蛋白合成基因(VvHT1-3，VvHT5-6)，1个ASR家族基因(VvMSA)， 3个蔗糖运输蛋白合成基因(VvSUC11，VvSUC12，VvSUC27)以及6个蔗糖代谢酶合成基因(VvcwINV，VvnINV，VvSS，VvSPS，VvGIN1，VvGIN2)。

2.4.1 葡萄果实单糖运输蛋白合成基因及VvMSA基因表达量变化趋势 通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测，转色后葡萄果实单糖转运蛋白合成基因的表达如图4所示。随着葡萄果实成熟，VvHT1的表达量在花后57～71 d较高，随后急剧下降，在花后85 d表达量呈现最低值，然后到采收期即花后100 d略有回升。VvHT2的表达量在花后57 d较低，之后快速升高，在花后71 d表达量达到最大值，之后略有降低并趋于稳定。VvHT3的相对表达量在果实成熟过程中有明显的波动，先降低再升高到最大值，随后又降低并维持稳定，在花后71 d表达量达到最大值。VvHT5的表达量呈上升的趋势，在花后57～71 d较低，在花后85 d迅速升高，花后 100 d达到最大值。VvHT6的表达表现为先升高后降低再升高，在花后64 d时表达量最高，花后85 d最低，其他3个时期表达量大致相同。VvMSA可调控VvHT1表达，它是ASR(ABA，胁迫和成熟诱导)蛋白家族成员。在葡萄成熟过程中，VvMSA的表达呈现先升高后降低的趋势。花后71 d时，VvMSA的表达量最高。

图3 ‘西拉’葡萄果实果实发育过程中可溶性糖质量浓度Fig.3 Mass concentration of soluble sugars during ‘Syrah’ grapes development

2.4.2 葡萄果实蔗糖运输蛋白合成基因表达量变化趋势 蔗糖转运蛋白基因的表达如图5所示。VvSUC11整体呈上调的表达趋势。花后 57～71 d，VvSUC11的表达量维持在稳定的较低水平，花后85 d，VvSUC11的表达量迅速增加，并维持在同一水平至花后100 d。VvSUC12的表达水平在葡萄转色至成熟的整个阶段存在波动，表达量先降低，在花后64 d的表达量最低，之后再升高，在花后85 d达到最高水平后，至花后100 d又降低。VvSUC27的表达整体呈下调趋势。在花后57 d的相对表达量较高，之后迅速降低，至成熟期，VvSUC27相对表达水平最低。

图4 ‘西拉’葡萄果实单糖转运蛋白合成基因及VvMSA基因表达量Fig.4 Relative expression changes of monosaccharide transporters and VvMSAin‘Syrah’ grapes

图5 ‘西拉’葡萄果实蔗糖转运蛋白合成基因表达量Fig.5 Relative expression changes of sucrose transporters in ‘Syrah’ grapes

2.4.3 葡萄果实中蔗糖代谢相关酶基因表达量的变化趋势 图6显示，VvGIN1整体呈下调的表达模式。在转色初期即花后57 d，表达量最高，随后表达量逐渐降低，至成熟期即花后100 d，VvGIN1的表达量最低。VvGIN2的表达量呈先升高后降低的趋势，花后71～85 d的表达量较高，在成熟期的表达量最低。VvSS的表达量呈先升高再降低再升高的趋势，花后57～85 d的表达量较低，成熟期即花后100 d 的表达量最高。VvSPS的表达量在果实成熟过程中呈先升高后降低的趋势，在花后57～71 d，以及花后100 d的表达量较低，在花后85 d表达量最高。VvnINV在花后57 ～71 d的表达水平趋于稳定，随后逐渐降低，在花后100 d的表达量最低。VvcwINV整体呈上调的表达趋势。花后57～71 d，VvcwINV的表达量较低，随后迅速升高，至成熟期其表达量最高。

图6 ‘西拉’葡萄果实编码蔗糖代谢相关酶基因表达量Fig.6 Relative expression changes of related genes encoding sucrose metabolic enzymes in ‘Syrah’ grapes

3 讨论与结论

果实中可溶性糖的组分、质量分数及其比例在很大程度上决定了果实的品质与风味，研究葡萄果实中可溶性糖的种类及代谢，可以为调控果实糖代谢、提高果实以及葡萄酒品质及进一步开展相关研究提供理论依据。果实糖积累水平最终取决于相关基因的表达与调控，糖代谢的过程非常复杂，由多个基因表达及相关酶综合调控，因此明确葡萄果实生长发育过程中糖代谢相关基因表达对于研究酿酒葡萄糖代谢及提高葡萄品质十分必要。本研究中，‘西拉’葡萄果实糖积累主要为葡萄糖和果糖，其质量分数随着葡萄果实的发育而不断升高，葡萄糖质量分数始终高于果糖。

近年来，参与葡萄糖代谢的相关酶和基因引起许多研究者的关注。随着分子生物学技术的快速发展，葡萄果实中编码细胞壁酸性转化酶(VvcwINV)和液泡酸性转化酶(VvGIN1、VvGIN2)的基因已经被克隆[13]。各种单糖和蔗糖运输蛋白共同承担着果实中糖类物质的跨膜运输[14]，同时它们的表达具有时空特异性，不同生长时期的表达水平不同。

己糖运输蛋白参与果实糖类从质外体运输进入果肉细胞的过程，己糖运输蛋白基因的表达与库组织从质外体卸载运输糖类物质关系密切[15]。对‘西拉’葡萄果实中5个单糖运输蛋白基因的表达分析表明，这几个基因在成熟过程中被差异表达。有研究发现，VvHT基因的表达与己糖的积累没有直接联系，表明转录水平不是转运活性的主要决定因素，或者其他转运途径也很活跃[13]。一种可能的解释是，糖类在成熟葡萄浆果中的运输不受基因转录水平的调节，而是受到转录后调节[16]。Conde等[17]，Céline等[18]的研究表明葡萄细胞培养物中VvHT1的转录水平受到葡萄糖的抑制，表明VvHT1可能不会介导转色后糖类输送至浆果细胞的过程，但VvHT1在幼果期的表达水平很高，表明VvHT1可能参与了细胞分裂和生长的能量供应[17-18]。Fillion等[19]的研究表明，VvHT2基因的表达与浆果己糖积累起始及快速升高同时发生，而VvHT1的表达与果实含糖量的增加没有密切关系。本研究中，VvHT1的表达水平在转色期较高，在成熟后期的表达较低，VvHT2与之相反。VvHT3的表达模式与VvMSA相似，在花后71 d的表达量最高，其他几个时期均较低。VvHT5的表达在转色期至成熟中期较低，在成熟后期的表达水平很高。各基因的表达模式存在差异，表明在不同生长时期，可能是由不同的基因发挥作用，进行葡萄糖和果糖的转运。VvHT基因的表达与己糖的积累与运输是否具有直接联系可能还与葡萄品种、自然环境因素以及栽培措施等因素有关。

在葡萄果实中鉴定的 3 个蔗糖运输蛋白cDNA 中[6-7]，VvSUC11和VvSUC12在果实中的表达随液泡中己糖积累的起始而增强，而VvSUC27的表达模式则相反，其转录随着果实成熟而下降。本研究中，VvSUC11和VvSUC12表达水平上调，而VvSUC27呈下调的表达趋势，这与前人在‘西拉’葡萄中的研究结果较一致[6]。果实中多个蔗糖运输蛋白在发育过程中的差异表达表明蔗糖运输与积累的调节是十分复杂的。

VvGIN是编码液泡内蔗糖水解酶的基因，VvGIN1和VvGIN2在果实生长发育前期转录、表达增加，但成熟后期却降低，mRNA积累模式与可溶性转化酶活性的增加一致[6,20-21]。本研究中VvGIN1呈下调的表达趋势，VvGIN2的表达量表现为先升高后降低，两者相比，VvGIN2的表达较弱，两者在成熟后期的表达量降低，与前人的研究结果较一致。

SS和SPS与葡萄果实中蔗糖的合成与分解密切相关。SS的主要功能为分解蔗糖，催化如下的反应：蔗糖+UDP→果糖+UDPG；SS的活性水平在转色期后略有增加，但仍然比转化酶低约100倍[22]。SPS是植物中调控蔗糖合成的关键酶，是光合产物向蔗糖和淀粉分配的一个关键调控点，其主要功能是合成蔗糖。大量研究表明VvSPS基因只有在一定的发育阶段及组织中才会开始表达[23-24]。冷翔鹏等[25]以‘夏黑’葡萄果实cDNA为模板，通过对葡萄EST数据库糖代谢途径有关基因的分析表明，VvSS在葡萄浆果的整个发育过程中均有强烈的表达，VvSPS在整个浆果生长期的表达相对较弱。高表达的VvSS和低表达的VvSPS使得葡萄浆果积累己糖，分解蔗糖，这与前人关于葡萄浆果主要积累葡萄糖与果糖，蔗糖质量分数极微[9,26]的研究结论一致。本研究中VvSS的表达水平在转色期到成熟中期较低，在成熟后期升高。VvSPS的表达在花后85 d最高，在其他时期较低。与前人研究认为的VvSS在整个葡萄浆果发育过程中均有强的表达有所差别，这可能与葡萄品种有关。

综上所述，葡萄浆果中糖的积累伴随着蔗糖转运蛋白合成基因、编码转化酶基因和单糖转运蛋白合成基因等的协同表达。‘西拉’葡萄果实中可溶性糖代谢相关基因表达模式存在差异，相关基因的表达和调控共同促进果实中糖的积累。VvHT基因的表达与己糖的积累没有直接联系，随着液泡中己糖的积累，葡萄浆果中VvSUC11和VvSUC12表达水平上调，而VvSUC27呈下调的表达趋势。果实中糖的积累首先取决于浆果内在遗传特性，此外，还可能与气候条件及栽培措施等因素有关[9]。