孙光伟，陈振国，王玉军，孙敬国，冯吉，于涛，李建平，覃光炯

1 湖北省烟草科学研究院，武汉 430030；2 山东农业大学，泰安 271018

烤烟优质上部叶对卷烟香味及其风格具有很大贡献[1-2]，上部4～6片一次成熟采收技术的推广提高了上部叶的可用性[3-4]，但烤后上部叶组织结构紧密，烟碱、蛋白质、淀粉含量较高，化学成分不协调，刺激性大，杂气较重等问题仍影响其在卷烟配方中的使用，而造成这一现象的根本原因是成熟度不够[5-7]。烟叶成熟的过程实质是叶片生理衰老的过程，成熟度作为烟叶质量的核心，目前主要通过眼看、手摸等感官方法判断[8]，大量研究表明采收成熟度与叶片组织结构[9-11]、生理生化[12-16]、吸食质量及安全性[17-18]等密切相关，基于叶面颜色、主脉变白情况进行成熟度分类，主观差异较大，缺乏客观量化分析。

叶绿素计通过发射易被叶绿素吸收的红光（峰值波长650 nm）和不被叶绿素吸收的近红外光（峰值波长940 nm）来计算叶片表征叶绿素相对含量的SPAD值（Soil and Plant Analyzer Development，可译作土壤与作物分析仪器开发，指一种测量叶绿素浓度的方法，SPAD值即采用该方法测得的叶绿素相对浓度值），实现快速、无损判定叶片叶绿素含量从而客观反映成熟度[19-21]。本试验设置上部叶采收不同的SPAD值，量化SPAD值与鲜烟叶组织结构、生理指标及烤后烟叶质量的关系，以期确定上部叶最佳采收成熟度，为提高上部烟叶可用性提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2018年在恩施州利川柏杨镇进行，供试品种为云烟87，土壤为砂壤土，有机质2.25%，pH为5.64，速效氮91.00 mg/kg，有效磷67.92 mg/kg，速效钾192.00 mg/kg。施肥量纯氮90 kg/hm2，m(N)∶m (P2O5)∶m (K2O)=1∶1.5∶2.5，行距1.2 m，株距0.55 m。其他技术措施和田间管理按优质烟生产技术规程实施。

1.2 试验设计

选取上部叶成熟度一致的烟田，中部叶采收结束后, 烟株留取上部六片叶片，上部四片一次成熟采收，顶部两片弃采。在叶片的叶尖、叶中和叶基3个位置主脉两侧用SPAD-502PLUS仪（KONICA MINOLTA）读取SPAD值，取四片叶24个点的平均值为上部叶采收的SPAD值，上部叶成熟期进行田间动态监测，按平均值在9±1.5、13±1.5、17±1.5、21±1.5、25±1.5范围进行上部四片采收分成5类。每类选取30株挂牌采收后按照同一工艺曲线进行烘烤，各阶段稳温时间根据烟叶变化情况灵活掌握。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 生理生化指标

采收时每类随机选取3株上部叶挂牌设为三次重复，采用美国LI-Cor 公司生产的LI-6400便携式光合测定系统测定光合参数，人工控制CO2浓度400 μmo1∙mol-1，25℃，光照强度 800 μmol∙m-2∙s-1，于采收当天上午10点测定，测量四片上部叶的净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间CO2浓度（Ci）、蒸腾速率（Tr）；采后冰盒带回用蒸馏水洗净，擦干，在叶中部主脉一侧2～3 cm处打孔，打孔取下的叶片用于生理指标测定，转化酶（invertase，INV）、吲哚乙酸氧化酶（indoleacetic acid oxidase，IAAO）采用上海索桥生物科技有限公司试剂盒测定，硝酸还原酶（nitrate reductase，NR）、超氧化物歧化 酶（superoxide dismutase，SOD）、 过 氧 化 物酶（peroxidase，POD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）等酶活性及过氧化氢（H2O2）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。

1.3.2 鲜烟组织结构测定

剩余叶片中部主脉另一侧2～3 cm处取下的样品用FAA（70%酒精）固定液固定保存，按照常规的石蜡切片步骤，进行逐级酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋和切片，采用番红-固绿染色，对制好的切片利用OLYMPAS显微影像分析软件测定叶片厚度、海绵组织厚度、栅栏组织厚度；自由水和束缚水含量、叶绿素含量的测定方法参照《植物生理学试验指导进行》[22]。

1.3.3 常规化学成分测定

每类烤后叶片随机选取9株，每3株12片烟叶混合为一次重复，80℃烘干至恒质量，剔除主脉和较粗的支脉，研磨粉碎过250 μm 筛保存。常规化学成分检测采用美国API公司生产的305D型连续流动分析仪参照行业标准测定；多酚含量参照行业标准[23]测定，TSNAs含量采用液质联用[24]测定。

感官品质鉴定：每类随机选取B2F等级20片切丝用于感官品质鉴定，由湖北中烟工业有限责任公司技术研发中心进行感官评价，选取香气质、香气量、杂气、刺激性、余味、燃烧性、灰色、浓度、劲头等指标，参照YC/T 415—2011烟草在制品感官评价方法[25]制订评分标准，见表1。

1.4 数据处理

采用Excel进行数据处理及作图，SPSS19.0 进行多重比较（Duncan法）。

表1 感官评价评分标准Tab.1 Standards of evaluation of smoking sensory quality 分

2 结果与分析

2.1 不同SPAD值上部叶片光合特性

图1为不同SPAD值上部叶片外观及叶绿素含量，从中可以看出随着SPAD值升高叶片叶绿素a、叶绿素b及叶绿素总量呈上升趋势，叶片绿色程度逐渐加深；叶绿素含量（y1）与SPAD值（x）呈线性相关，y1= 0.0424x+ 0.2477（R² = 0.9823）。

图1 不同SPAD值上部叶片外观及叶绿素含量Fig.1 The leaf appearance and chlorophyll content of upper leaves with different SPAD values

从表2可知，SPAD值在21±1.5时采收，上部叶净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度、蒸腾速率达到最高后开始下降趋于衰老；SPAD值低于9±1.5时采收，净光合速率显著降低，气孔导度和蒸腾速率均较低，表明叶片衰老严重，光合作用明显减弱。净光合速率（y2）与采收时SPAD值呈一元二次关系，y2= -0.6957x2+ 5.6523x- 1.598（R² = 0.9717）。

表2 不同SPAD值上部叶片的光和参数Tab.2 Photosynthetic parameter of leaves with different SPAD values

2.2 不同SPAD值上部叶片组织结构

从图2可以看出，随着叶片SPAD值的升高，叶片海绵组织呈降低的趋势，栅栏组织呈上升的趋势，可见降低采收SPAD值可改善上部叶组织结构的疏松程度；采收时SPAD值与叶片海绵组织栅栏组织的比值（y3）呈负相关，y3= -0.0094x2+ 0.0162x+ 0.8646（R²= 0.9877）。

图2 不同SPAD值上部烟叶的组织结构Fig.2 The mesophyll structure of upper leaves with different SPAD values

2.3 不同SPAD值上部叶生理指标

2.3.1 鲜烟叶水分含量

图3 不同SPAD值上部叶鲜烟叶水分含量Fig.3 The moisture content of upper leaves with different SPAD values

植物组织中的水分以两种不同的状态存在，一种是与原生质胶体紧密结合的束缚水，另一种是不与原生质胶体紧密结合而可以自由移动的自由水。从图3中可以看出随上部叶采收时SPAD值升高，自由水含量变化不大，束缚水含量呈下降趋势，自由水/束缚水比值（y4）呈升高趋势，y4= 0.3413x+ 1.6907（R²= 0.9393），上部四片采收时SPAD值低于17时，束缚水含量显著增加，自由水/束缚水比值显著降低，代谢减弱趋于成熟。

2.3.2 鲜烟叶碳氮代谢产物及相关酶活性

由表3可知，随着叶片SPAD值的升高，蛋白质的含量（y5）逐渐升高，y5= 18.209x+ 115.94（R²= 0.8586）；硝酸还原酶（NR）活性逐渐升高，当SPAD值低于13±1.5时NR活性显著降低；蔗糖含量随着叶片SPAD值的升高逐渐降低，蔗糖转化酶活性逐渐升高，α、β淀粉酶、总淀粉酶活性及淀粉含量均随SPAD值的降低而呈现先升高后降低的趋势。

表3 不同SPAD值上部烟叶碳氮代谢产物及关键酶活性Tab.3 Carbon and nitrogen metabolites and key enzyme activities of upper tobacco leaves with different SPAD values

2.3.3 鲜烟叶氧化胁迫生理指标

从表4中可以看出，随着叶片SPAD值的降低，IAAO活性逐渐增加，H2O2含量、POD、SOD、CAT活性呈先降低后显著增加的趋势；当SPAD值低于13±1.5时POD活性、SOD活性、CAT活性、H2O2含量、MDA含量显著增加，在9±1.5范围内IAAO活性显著增加，H2O2、MDA含量显著增加，上部叶氧化胁迫加重。

表4 不同SPAD值上部烟叶氧化胁迫生理指标Tab.4 Physiological index of oxidative stress in upper tobacco leaves with different SPAD values

表5 不同SPAD值采收烤后烟叶多酚含量Tab.5 Contents of polyphenols in flue-cured tobacco leaves with different SPAD values mg/g

2.4 不同SPAD值采收对烤后上部烟叶内在品质的影响

2.4.1 对烤后烟叶多酚含量的影响

从表5可以看出随着采收烟叶SPAD值降低，绿原酸、芸香苷、多酚总量呈上升趋势，多酚总量（y6）与SPAD值含量呈线性相关，y6= -1.8172x+ 28.073（R²= 0.9515）。

2.4.2 对烤后烟叶常规化学成分含量的影响

从表6烤后烟叶常规化学成分可以看出，随着采收叶片SPAD值降低，烟碱含量（y7）显著增加，与SPAD值含量呈线性相关，y7= -0.1723x+ 3.6577（R²= 0.8661）；还原糖、总糖呈先升高后降低的趋势，钾离子含量呈先降低后升高的趋势。

表6 不同SPAD值采收烤后烟叶常规化学成分含量Tab.6 The chemical components of tobacco leaves with different SPAD values when harvesting

2.4.3 对烤后烟叶TSNAs含量的影响

从表7可以看出随着采收SPAD值降低，NAT、NAB、TSNAs含量逐渐降低，NNK含量随着采收SPAD值降低呈先降低后升高的趋势。当采收SPAD值在9±1.5内TSNAs含量显著降低，主要表现为NNN、NAT、NAB含量降低，TSNAs含量（y8）与SPAD值含量呈线性相关，y8= 38.387x+ 337.74（R² =0.9566）。

2.4.4 对烤后烟叶感官质量的影响

从表8中可以看出，随着采收烟叶SPAD值的降低，烤后烟叶感官评吸质量呈升高后降低的趋势，SPAD值低于17时烟叶杂气得到明显改善。SPAD值在13±1.5范围内烤后烟叶感官评吸质量最高，香气质较好，余味较舒适；其次为SPAD值9±1.5，随着成熟度进一步提高，香气质、余味变差。

表7 不同SPAD值烤后烟叶TSNAs含量Tab.7 Contents of TSNAs in tobacco leaves with different SPAD values when harvesting ng/g

表8 不同SPAD值采收烤后B2F烟叶感官质量评价Tab.8 The sensory quality evaluation of tobacco leaves with different SPAD values with harvesting

3 讨论

SPAD值与叶绿素含量呈线性正相关，可用于客观判断上部叶采收的成熟度[21]，本试验对进入采收期的上部四片烟叶SPAD值均值在9～25范围内进行成熟度细分，明确了上部叶采收SPAD值与鲜烟叶绿素含量、叶片含水情况、组织结构、净光合速率、蛋白质含量及烤后烟叶烟碱、多酚、TSNA含量之间的相关性，对指导上部叶成熟采收具有重要意义，同时为机器视觉鉴别烟叶适宜采收成熟度提供支撑[26-27]。

随着烟叶的逐渐成熟和衰老，叶色逐渐变黄，栅栏组织和海绵组织从最初的整齐排列到逐渐排列紊乱，光合色素降解加速，与光合作用等合成代谢相关蛋白多下调表达，而逆境反应及呼吸作用等分解代谢相关蛋白多上调表达[28]。本试验结果表明随着SPAD值降低束缚水含量升高，净光合速率降低，但光合产物蔗糖含量呈增加的趋势，与碳代谢关键酶INV活性降低有关，蔗糖水解能力减弱，光合产物得不到有效利用，淀粉酶活性先升高后降低，SPAD值17±1.5时采收糖积累代谢到达顶峰，此时采收烤后烟叶总糖、还原糖含量最高；随着采收SPAD值进一步降低，叶片为维持细胞正常代谢淀粉开始分解，烟叶碳氮代谢减弱，POD、SOD活性，H2O2、MDA含量显著增加，逆境胁迫增强，衰老程度加重。聂荣邦等[29]研究表明烤烟中部叶自欠熟至过熟束缚水含量渐次降低，而本试验上部叶成熟后，随着衰老程度加重，束缚水含量表现为逐次增加，可能与上部叶成熟后期温度降低有关，束缚水含量增加上部叶抗逆性增强，烘烤特性表现为脱水较难，需保湿变黄。

采收SPAD值与烤后烟叶多酚、烟碱含量呈线性负相关，进一步量化了前人[14-15]的研究结论。随着采收SPAD值降低成熟度提高，NR活性降低，烟叶氮素吸收能力降低，但总氮含量呈先降低后增加的趋势，可能与养熟过程中土壤养分供给能力较强有关，烤后烟叶烟碱含量持续增加，可见叶片衰老后氮素利用转向烟碱合成[30-31]，因此上部叶成熟期较低的土壤供氮能力尤为重要。采收成熟度影响亚硝酸盐和亚硝胺的积累[32]，张树堂等[17]研究表明不同成熟度烟叶亚硝胺含量过熟＞初熟＞适熟，而在本研究采收SPAD值范围内，SPAD值与TSNAs含量呈线性正相关，提高采收成熟度可降低TSNAs含量，可能与本试验设置的SPAD值9±1.5采收成熟度未达到其过熟标准有关；提高采收成熟度有利于减少变黄、定色时间，从而降低烟碱与硝酸盐反应时间[33-34]，NNN、NAT、NAB含量降低，上部叶吸食安全性提高；NNK呈先降低后增加的趋势，与总氮含量变化一致，有待进一步研究。

上部叶成熟特征与品种、气候、施肥等条件息息相关，本试验基于鄂西南烟区生态条件下的云烟87开展上部叶成熟度研究，其适宜采收成熟度范围为SPAD值13±1.5，此时采收的上部叶感官评吸质量最高，若成熟度进一步增加烟碱含量显著增加，香气质、余味变差。本试验不同SPAD值采收的烟叶在同一温湿度条件下烘烤制得，如何对量化分类的不同成熟度烟叶进行最佳工艺匹配，进一步彰显上部叶质量特色有待进一步研究。

4 结论

鄂西南烟区云烟87上部四片采收SPAD值均值适宜范围为13±1.5，此时采收成熟度适宜，烤后烟叶感官质量最佳，香气质好，杂气较少，TSNAs含量较低。