潘晶晶，佘晓燕，胡林福，施林巍，张 辉

（1.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州310058；2.浙江圣氏生物科技有限公司，浙江 湖州313399）

竹子是禾本科竹亚科的多年生常绿植物，含有多种次生代谢产物［1］，具有较好的应用价值。竹叶及其提取物中含有丰富黄酮类及其苷类化合物、特种氨基酸及其肽类、多糖类、芳香性成分以及人体所必需的常量元素如Fe、Ca、Si等和微量元素如Mn、Cu、Mo、V、Ni等［2］，竹叶的提取物中含有黄酮类物质，具有抗氧化、清除自由基、抗衰老、抗菌、抗炎、增强免疫力、保护心脑血管、调节血脂、抗血栓、抗辐射、抗癌等功效［3］。在食品添加剂使用标准GB 2760—2011中，首次将竹叶抗氧化物作为添加剂，可使用在油脂、肉制品、火腿等食品中，竹叶黄酮也在2014年被批准为新食品原料。

在香肠的制作和存放过程中，会加入一定量的亚硝酸盐。随着香肠存放时间的延长，原先添加的亚硝酸盐会分解变成亚硝胺［4］。而香肠中油脂氧化也会产生丙二醛（MDA），降低了其营养价值、感官特性和食用安全性。竹叶提取物中黄酮、氨基酸、多糖等物质具有抗氧化性，能阻遏食品氧化腐败，黄酮的含量越高，抗氧化能力就表现得越强，所以竹叶提取物可以阻断油脂的氧化，清除亚硝酸盐化合物并且阻断亚硝胺的合成［5］。本实验旨在研究不同黄酮含量的竹叶提取物对腌肉的抗氧化，阻断脂质的自动氧化、减少丙二醛和亚硝胺危害物质的生成的效果，为竹叶提取物的进一步开发和在工业上应用提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂 含有不同总黄酮含量的竹叶提取物由浙江圣氏生物科技有限公司提供，其中总黄酮含量分别为24%和18%。猪后腿肉、高原深井盐、异VC钠、亚硝酸钠，食品级。甲醇，色谱纯。乙二胺四乙酸二钠、三氯乙酸、硫代巴比妥酸，分析纯。

1.1.2 仪器与设备 D60高效液相色谱，安捷伦科技有限公司；HZ-9211K恒温振荡器，太仓市科教器材厂；DK-8D恒温水浴锅，上海跃进医疗器械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 制作腌肉 选取肥瘦均匀的猪后腿肉，将肉切成长约10 cm、宽约10 cm的块状，称取每块的重量，计算出配料的用量，在表面均匀地抹擦上食盐、亚硝酸钠、不同浓度的样品，然后于4℃冰箱冷藏室中腌制约20 d。

配料的用量取100 kg鲜肉用细盐16 kg，亚硝酸钠的添加量为0.15 g·kg-1，低黄酮含量的竹叶提取物、高黄酮含量的竹叶提取物各取0.5、1、2 g·kg-1，异VC钠取1 g·kg-1，每组两个平行，在腌制的上盐阶段加入。

1.2.2 检测丙二醛含量 20 d后将腌制好的腌肉按照国标GB 5009.181-2016的方法，采用高效液相色谱进行腌肉中丙二醛的检测。

（1）样品处理。提取：称取5 g腌肉样品，置于锥形瓶中，加入50 mL三氯乙酸混合液，置于恒温振荡器上50℃振荡30 min，取出，用双层定量慢速滤纸过滤。衍生化：将滤液和标准系列溶液各5 mL分别加在25 mL比色管中，加入5mL硫代巴比妥酸水溶液，在90℃水浴中反应30 min，冷却，取上清液过滤膜上机分析。

（2）液相色谱条件。色谱柱：C18柱5μm，4.6 mm×150 mm；流动相：甲醇∶0.01mol·L-1乙酸铵＝30∶70（V∶V）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30℃；进样量：10μL；检测波长：532 nm。

（3）丙二醛含量计算。试样中丙二醛的含量按式（1）计算：

式（1）中：X为试样中丙二醛含量，单位为毫克每千克（mg·kg-1）；V为试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）；m为最终试样溶液所代表的试样质量，单位为克（g）；c为从标准系列曲线中得到的试样溶液中丙二醛的浓度，单位为微克每毫升（μg·mL-1）；1 000为换算系数。

1.2.3 检测亚硝酸盐剩余量 20 d后将腌制好的腌肉按照国标GB 5009.33-2016食品安全国家标准采用分光光度法进行检测。

试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，外标法测得亚硝酸盐含量。

1.2.4 数据处理 利用Origin 8.5对数据进行处理并绘制图表。

2 结果与分析

2.1 HPLC测丙二醛含量

丙二醛标准品在选取的HPLC条件下分离效果比较好，且色谱峰的保留时间均为2.91 min。其中丙二醛标准品色谱图见图1左，添加了样品的丙二醛色谱图见图1右。对0.45、1、10 ppm的丙二醛标准溶液进行分析，以标准溶液浓度为横坐标，以色谱峰的峰面积为纵坐标作标准曲线如图2，其回归方程：y＝135.050 43x-561 568×10-4，相关系数R2＝0.999 9，结果表明，丙二醛在0.45～10 ppm浓度范围内线性关系良好。

图1 左为1 ppm标准溶液丙二醛衍生物色谱图，右为样品中丙二醛衍生物色谱图Fig.1 Left，the standard solution ofmalondialdehyde derivative chromatogram；Right，a chromatographic diagram ofmalondialdehyde derivatives in samples

图2 丙二醛标准曲线Fig.2 Malondialdehyde standard curve

2.2 腌肉中丙二醛含量

将HPLC检测得到的样品的峰值代入公式（1），得到添加了不同浓度样品腌肉的丙二醛含量，取平均值，并计算误差，计算丙二醛的抑制率如表1。

表1 各样品丙二醛含量Tab.1 Malondialdehyde content of each sample

图3 样品对丙二醛含量的影响Fig.3 The effect of sample on Malondialdehyde content

丙二醛（MDA）含量是肉制品中脂质过氧化程度的直接定量指标，直接关系到肉质和货架期。在相同的冷藏时间内，肌肉中的MDA含量越高，脂质过氧化速度就越快，肉质变差的时间就越短，肌肉货架期就相对较短［6］。结果表明，在不同总黄酮含量的竹叶提取物作用下，20天后腌肉中的MDA含量减少，其中高黄酮含量竹叶提取物的效果优于低黄酮含量竹叶提取物，但弱于异VC钠。

随着高黄酮含量竹叶提取物的浓度从0.05%增大到0.2%，其对MDA的抑制率由29.62%增加至85.07%，差异均达极显著水平（P＜0.01）。而低黄酮含量竹叶提取物随着浓度从0.05%增大到0.2%，对MDA的抑制率从15.46%增加至37.53%，差异也达到显著水平（P＜0.05）。本实验还选用了异VC钠作为对照，异VC钠是一种生物性食品抗氧化剂、防腐保鲜助色剂，少量异VC钠即可达到较好的抗氧化效果。测定出0.1%异VC钠对MDA的抑制率为57.51%，只有0.2%高黄酮含量竹叶提取物的抑制率85.07%超过了0.1%异VC钠的效果，差异达到极显著水平（P＜0.01），其他浓度样品的抑制率均显著小于异VC钠的效果（P＞0.05）。由此看来，不同黄酮含量的竹叶提取物在腌肉腌制过程中都具有抗氧化效果，能起到抑制丙二醛的作用，并且高黄酮含量竹叶提取物具有较强的抗氧化功效，在0.2%浓度下能够达到并超过常用抗氧化剂0.1%异VC钠的效果，对脂质过氧化物丙二醛的生成具有明显的抑制作用。在梁仁龙［7］的研究中，添加竹叶抗氧化物可有效抑制酱鸭的菌落总数、挥发性盐基氮、过氧化值和酸价，对于肉制品有较好的抗氧化和保鲜的功效。

2.3 腌肉中亚硝酸盐剩余量

测量得到添加了不同浓度样品的腌肉中亚硝酸钠含量，取平均值，并计算误差，计算得到亚硝酸钠的剩余量如表2。

表2 各样品亚硝酸钠剩余量Tab.2 Residual amount of sodium nitrite in each sample

图4 样品对亚硝酸钠剩余量的影响Fig.4 The effect of sample on residual amount of sodium nitrite

在腌肉腌制过程中通常加入亚硝酸盐，其在一定条件下会与二甲胺反应生成N-亚硝基化合物，具有致突变和致癌性，过量食用存在安全性问题。在朱清清［8］的研究中，发现二甲基亚硝胺、二乙基亚硝胺和吡咯烷亚硝胺的残留量随着竹叶提取物添加量的增加而显著降低，三种亚硝胺的抑制作用明显；在徐涛［9］的研究中，发现随着竹叶提取物含量的增加，腌制水产品中的亚硝胺量明显下降，说明竹叶提取物对于亚硝胺的抑制有一定的作用。在本实验中，腌肉腌制中亚硝酸盐的添加量为150 mg·kg-1，剩余量越多，说明转化为的亚硝胺越少，毒性越小。

由结果可以看出，相比于空白组，两种添加物对亚硝酸盐的转化都有明显抑制，且都随浓度增大，抑制作用越明显。随着高黄酮含量竹叶提取物的浓度从0.05%增大到0.2%，亚硝酸盐的剩余量从0.877 mg·kg-1增加到1.138 mg·kg-1，差异均达极显著水平（P＜0.01）。低黄酮含量竹叶提取物随着浓度从0.05%增大到0.2%，亚硝酸盐的剩余量从0.507 mg·kg-1增加到0.747 mg·kg-1，差异也能达极显著水平（P＜0.01）。

相比于对照组异VC钠，不同黄酮含量竹叶提取物的抑制效果都弱于异VC钠。在许钢［10］等的研究中，适量的竹叶提取物可阻断亚硝胺的合成；在楼鼎鼎［11］等的研究中，添加竹叶抗氧化物能有效降低制品中的亚硝酸残留量，并呈显著的量效关系，这都与本文的结果相符。综合来说，竹叶提取物具有抑制亚硝酸盐转化为亚硝胺的能力，并且黄酮含量的越高，抑制能力越强，但其抑制作用都弱于异VC钠。

3 结论

将不同黄酮含量的竹叶提取物添加到腌肉中，腌制20 d后，发现两者对丙二醛均有显著抑制，且0.2%高黄酮含量竹叶提取物的抑制率能达到85.07%，相比对照组0.1%异VC钠提高了27.56%（P＜0.01），表明其对脂质过氧化物丙二醛的生成有明显的抑制作用。不同黄酮含量的竹叶提取物对抑制亚硝酸盐转化为亚硝基化合物有一定的作用，0.2%的高黄酮含量竹叶提取物可有效保留腌肉中亚硝酸钠的含量，减少对人体有害的亚硝胺的生成。

竹叶提取物是一种较好的食品辅助功能性产品添加剂，具有良好的抗氧化和抑制丙二醛作用，抑制亚硝酸盐转化为亚硝胺的功效。本次实验为之后进一步产品应用提供了一定的理论依据。但是目前得到的结论都是停留在宏观上，对于其产生功效的作用机制，还需要从微观结构上进行分析。并且在实验中使用的浓度并没有经过精确筛选，还需要进一步优化，探究浓度范围。总的来说，竹叶提取物可作为一种天然有效的抗氧化剂应用于食品中，具有广阔的前景。