李周雷 张祥松

肿瘤细胞可以改变其生存环境来抑制免疫系统活性以利于其生存和增殖［1,2］。靶向肿瘤微环境的治疗已成为十年来癌症治疗的新焦点。免疫治疗在癌症治疗中的成功，特别是 PD-1/PD-L1 和 CTLA-4 抗体的使用，推动了其他免疫治疗标靶的高速发展［3,4］。然而，免疫疗法只对小部分癌症患者有效［5］。联合疗法增加癌细胞对治疗的反应并阻断了癌细胞的逃逸机制［6］。联合治疗的成功往往依赖于肿瘤中免疫细胞的活性及其与肿瘤细胞中所表达的抑制癌细胞生存的免疫配体间的相互作用［7］。非浸润性（“冷”）肿瘤对靶向 Check Point 抑制剂具有抗性，新的免疫疗法往往具有针对肿瘤抗原和免疫受体的双特异性结构， 以增强免疫细胞的渗透性和针对肿瘤细胞的特异性。双特异性抗体（卡托马索布、CD3 +EpCAM 和Blinatumomab、CD3+CD19） 已获美国食品和药物管理局（FDA）上市批准，还有更多抗体处于临床或临床前开发［8］。随着分子抗体工程的兴起，越来越多的双特异性抗体正被用于各种抗癌治疗中［9］。

随着靶向性免疫治疗的不断发展，肿瘤抗原在体表达以及免疫渗透的可视化对预测肿瘤对治疗的反应来说越来越重要。标记抗体分子的成像方法已被广泛研究，但大分子抗体组织穿透性差以及生物半衰期过长成为是其难以成为理想显像剂的障碍。因此，纳米抗体成为用于体内和体外成像进行诊断的热点［10］。由于纳米体体积小且无Fc片段，因此纳米抗体可被快速从体内消除，从而提高靶目标与本底的对比度也提高了组织的渗透和显像效果，实现对免疫治疗准确且快速的诊断（图1）［11］。对于不适合纳米抗体标记的靶向目标（如N-Hydroxysuccinimide，NHS）目前所采取的主要策略是使用酶介导耦合［12,13］。酶介导耦合是一种非常简单、经济高效且用途广泛、以受控方式标记生物分子的方法，可实现定向耦合，例如使用99mTc-三碳基标记定向耦合探针进行单光子发射计算机断层扫描 （SPECT）［14］。

在非无创性成像中最先进的纳米抗体是Her2 抗体被用于检测乳腺癌中的Her2 表达的PET/CT 成像。Ⅰ期临床试验表明其体内消除实践短，可在注射后60～90 min 进行成像［15］；目前，以68Ga 标 记 的 （68Ga-NOTA-Anti-Her2） 纳米抗体为示踪剂的 PET/CT 成像（NCT03331601）以监测其在脑转移瘤中的摄取情况正在进行Ⅱ期临床试验； 另外，CD20［16］、二甲酰二甲苯酶 6［17］、Her3 纳米抗体［18］探针也正在研发中。

图1 纳米抗体探针与一般免疫蛋白探针的体量比较

由于T 细胞的渗透和活性对免疫治疗反应至关重要，使其成为分子成像中特别有意义的靶标。Mitsunaga 等［19］使用ART2 纳米抗体作为探针，对淋巴结内的T 细胞进行光学成像， 并且由于此纳米抗体探针有抑制 ART2 的特性， 使其还可同时用于治疗和免疫调节；89Zr 标记的CD8纳米抗体 PET/CT 探针被用于监测肿瘤内的 CD8 阳性 T细胞渗透。此纳米抗体只有20kDa 的大小可大大减少其在肾脏内的潴留， 从而对淋巴器官进行更精确的显像［20］。研究表明，对免疫调节的B16 小鼠进行CTLA-4 抗体免疫治疗时，CD8+纳米抗体PET/CT 显像证实此显像剂的摄取与肿瘤对 CTLA-4 抗体免疫治疗的反应相关［20］。另外，直接靶向 Check Point 的99mTc 标记 PD-L1 纳米抗体 SPECT 成像显示，PD-L1 表达与CD8+依赖性肿瘤对治疗的反应相关［21］。

极化的巨噬细胞是另一个重要的预后标志物，巨噬细胞甘露糖受体（macrophage mannose receptor，MMR）的纳米抗体已用来检测肿瘤相关的巨噬细胞 （tumor associated macrophages，TAMs）。Movahedi 等［22］已成功地利用99mTc 标记的纳米抗体来检测小鼠体内的TAMs。在后续研究中，研究者们分析了99mTc 标记的 SPECT 或18F 标记的PET/CT 成像探针（MMR 纳米抗体探针）的性能。他们的研究结果表明，与放射性金属标记的氟化钠纳米抗体相比，它们的肝脏和肾脏吸收量有显著性降低［23］。

Ⅱ类主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex Ⅱ，MHC-Ⅱ）是一种较好的预后靶标，与某些免疫系统抗原表达相关。近来，一种标有类红外氟铬的MHC-Ⅱ纳米抗体被用于监测NOD/SCID 小鼠体内的人类免疫细胞的渗透，且该纳米抗体可有效的对器官进行标记并可用于流式细胞分析。研究者们使用64Cu 对其标记以用于体内成像，虽然其在肾脏和膀胱中有非特异性积累，但由于其良好的信噪比，使其在针对脾脏和骨骼中的MHC-Ⅱ阳性细胞的成像中表现优异［24］。研究者们还研发出将MHC-Ⅱ纳米抗体与组织高亲和性的18F-2-脱氧氟葡萄糖 （18FFDG）进行连接的高亲探针，结果表明，此探针比其他低亲和力的18F 标MHC-Ⅱ纳米抗体的显像效果有着显著提高。这种组织高亲探针可用于早期的因代谢活性低而不能被18F-FDG 发现的肿瘤（直径约1 mm），从而有效提高了肿瘤显像的精确度［25］。

近年来越来越多的临床前研究表明，纳米抗体是一种强大的抗体工程的工具，其可以取代单链变化片段（singlechain variable fragment，scFv）片段作为构建基块，建立稳定性好、耦合效率高、组织穿透性好以及从血流中快速快的非常有效的显像剂。在不久的将来，利用纳米抗体将生产出许多具有高潜力的分子用于癌症免疫成像和免疫治疗。