刘宇宁,杨珍,周治文, 查文良, 孔东波

湖北科技学院 1药学院，2临床医学院(湖北咸宁 437100); 3咸宁市中心医院(湖北科技学院附属第一医院)泌尿外科(湖北咸宁 437100)

近年来，随着人们生活水平的提高，高脂饮食所造成的肥胖症逐渐成为一个普遍的社会问题，它严重威胁着人们的健康，并可导致雄性激素分泌减少、睾丸发育异常、精子数量和质量下降等生殖系统损伤的发生，然而其具体发生机制未明。现有研究认为睾丸组织中的氧化还原平衡对于维持睾丸的正常生理功能具有十分重要的意义。然而，睾丸组织中含有大量的不饱和脂肪酸，且抗氧化能力较差，脂肪的过度摄入会增加活性氧(reactive oxygen species, ROS)和脂质过氧化终产物从而促进氧化应激水平，最终导致睾丸损伤和生精功能的扭曲[1]。此外，方芳等[2]研究发现高脂饮食大鼠睾丸细胞周期阻滞和凋亡增加，从而导致睾丸生精细胞分裂和增殖减少。当归补血汤是中医经典方剂，已流传超过800年，主要由当归和黄芪熬制而成，具有补气生血之疗效。现代药理学研究表明当归中含有大量的阿魏酸，具有增加冠状动脉血流量、抗血小板凝聚等作用，同时发现其具有较强的抗氧化能力[3]。本实验从2018年4月至2019年3月通过高脂饮食建立肥胖模型，探究当归补血汤对大鼠睾丸的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药品与仪器

1.1.1 实验动物 雄性SPF级wistar雄性大鼠50只(110±10)g，购于北京维通利华公司(动物合格证号：SCXK(京)2016-0006)。在室温(22±2)℃、湿度40%的动物房，昼夜节律12 h适应性喂养1周，自由饮食饮水。

1.1.2 药品与试剂 当归与黄芪购于湖北科技学院第二附属医院；高脂饲料(80.3%普通饲料+10%猪油+2.5%胆固醇+0.5%胆酸钠)购于北京科澳协力饲料有限公司；罗格列酮购自成都恒瑞制药有限公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒购自南京建成生物科技有限公司；Beclin-1、LC3B、Bax、Bcl-2多克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.1.3 主要实验设备和仪器 电子天平、3-18K高速冷冻离心机(德国Sigma公司)、正置荧光显微镜(德国Leica公司)、多功能酶标仪(瑞士Tecan spark公司)、化学发光成像系统(美国伯乐ChemiDoc)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及给药方法 大鼠随机分为正常对照组(n=10)、高脂模型组(n=10)、当归补血汤低剂量组(n=10)、当归补血汤高剂量组(n=10)、罗格列酮对照组(n=10)。除正常对照组给予普通饲料喂养外，其余各组均给予高脂饲料喂养，不限制饮水。当归补血汤低、高剂量组每天同一时间段分别灌胃6、12 g/kg当归补血汤煎液(低剂量：将黄芪∶当归按5∶1的比例称取105 g药材于8倍体积纯水中浸泡1 h后加热至沸腾后计时煎煮1 h，滤过残渣后另加6倍体积纯水继续煎煮1 h，混匀2次滤液于95℃水浴浓缩成210 mL当归补血汤煎液，冷藏备用；高剂量：按同比例称取210 g药材同法煎至210 mL当归补血汤煎液，冷藏备用)，罗格列酮对照组每天灌胃罗格列酮溶液4 mg/kg，喂养12周。

1.2.2 精子计数及活力统计 将麻醉后的大鼠左侧附睾尾部取出置于37℃生理盐水中剪碎混匀，取部分混匀液于清洁玻片上置于高倍光学显微镜下分别计数5个视野的活跃及不活动精子数，计算精子活动率(精子活动率=活跃精子数/总精子数×100%)。吸取精子悬液加入37℃生理盐水中混匀后滴入细胞计数板，计数中央5个中方格的精子数，用平均数乘以109即为每升精液中的精子数。

1.2.3 光镜观察睾丸组织结构变化 睾丸组织通过bouin′s固定液固定过夜后，石蜡包埋，蜡块切片，HE染色后光镜下观察组织结构变化。

1.2.4 大鼠睾丸组织中MDA及SOD含量测定 取大鼠睾丸组织按1∶9加入生理盐水研磨后制得10%生理盐水匀浆，按照试剂盒说明书操作步骤用酶标仪测得样本OD值后，计算出样本MDA及SOD含量。

1.2.5 Western免疫印迹技术 称取约50 mg大鼠睾丸组织后加入含有蛋白酶抑制剂以及磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液冰浴研磨30 min后取上清液测定蛋白浓度，电泳转膜后孵育不同浓度的一抗，显影后应用image lab软件进行灰度值统计。

2 结果

2.1 精子计数及精子活力统计 与正常对照组比较，高脂模型组大鼠精子活力及数量均显著降低(P<0.05)；当归补血汤低、高剂量组大鼠的精子数量与活力显著增加，与高脂模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；罗格列酮对照组的精子活力有所上升，然而精子总数水平较低，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，与当归补血汤相比疗效较差，见表1。

2.2 睾丸组织显微结构变化 正常对照组大鼠睾丸曲细精管有完整的被膜，生精上皮的各级生精细胞排列有序，多数为6～7层，曲细精管管腔内可见大量精子。高脂模型组大鼠睾丸曲细精管萎缩、变形，生精上皮的细胞层次显著减少，排列紊乱，多为3～4层，曲细精管内可见脱落的生精细胞，精子生成明显减少。当归补血汤低、高剂量组大鼠睾丸曲细精管形态与正常对照组类似，生精上皮损害明显减轻，并有精子生成。罗格列酮对照组部分层次恢复，但仍有生精细胞脱落，且无明显精子生成，见图1。

组别精子活力(%)精子浓度(×109·L-1)正常对照组59.7±11.52.5±0.5高脂模型组29.0±10.4∗1.3±0.3∗当归补血汤低剂量组41.8±9.9△2.8±0.5△当归补血汤高剂量组44.7±4.7△3.4±0.5∗△罗格列酮对照组46.1±8.5△0.8±0.3∗

*与正常对照组比较P<0.05; △与高脂模型组比较P<0.05

2.3 睾丸组织SOD和MDA检测结果 与正常对照组比较，高脂模型组SOD水平明显降低，MDA水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与高脂模型组比较，当归补血汤低、高剂量组以及罗格列酮对照组SOD水平升高，MDA水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.4 睾丸组织相关蛋白表达变化 与正常对照组比较，高脂模型组Bax/Bcl-2比值以及Beclin-1、LC3B蛋白水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与高脂模型组比较，当归补血汤低、高剂量组大鼠睾丸组织中Bax/Bcl-2比值以及Beclin-1、LC3B蛋白水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，与正常对照组比较，罗格列酮对照组Bax/Bcl-2比值较高，差异有统计学意义(P<0.05),见图2、表3。

A:正常对照组；B:高脂模型组；C:当归补血汤低剂量组；D:当归补血汤高剂量组；E:罗格列酮对照组

图1各组睾丸组织显微结构变化(HE，×400)

组别SOD(U/mL)MDA(nmol/L)正常对照组43.3±3.933.9±4.5高脂模型组37.4±0.7∗45.7±7.8∗当归补血汤低剂量组45.5±1.4△31.3±7.2△当归补血汤高剂量组47.8±3.4△25.4±11.4△罗格列酮对照组49.0±4.5△30.1±7.8△

*与正常对照组比较P<0.05; △与高脂模型组比较P<0.05

图2 各组大鼠睾丸组织相关蛋白表达比较

3 讨论

随着生活节奏的加快，快餐及油炸食品等高油高脂的食物成为了现在社会的主流餐饮，然而高脂饮食给人们带来的不止是肥胖，同时对人体的心血管、神经、生殖能力等诸多方面带来不利的影响。肥胖将影响男性生殖功能已经被证实，然而越来越多的证据表明未达到肥胖标准的高脂饮食人群的生殖能力较正常饮食的人群相差很多[4]。在Togo等[5]的研究中高脂饮食诱导11周后大鼠出现了肥胖症状，在机体自我调节的作用下大鼠的血脂与正常组相比没有显著性差异，但脂质代谢的负担仍影响了大鼠线粒体超氧阴离子的产生和膜流动性的稳定。本实验发现高脂饮食不仅减少大鼠精子活力与精子浓度，而且可使睾丸曲细精管萎缩、变形，生精上皮的细胞层次减少；然而，当归补血汤治疗后可显著改善大鼠精子活力与精子浓度，减轻大鼠生精上皮损害，这些结果表明当归补血汤对高脂饮食大鼠的睾丸损伤具有保护作用。罗格列酮对大鼠睾丸具有保护作用，可以防止外界刺激对睾丸组织的损伤[6]，同时有文献报道指出罗格列酮可以显著改善因高脂饮食引起的线粒体损伤[7]。同时罗格列酮作为工业化产品具有稳定的药效，因此我们将罗格列酮作为阳性对照药物与当归补血汤一同长时间服用，以此来比较当归补血汤对高脂饮食造成的睾丸损伤的修复作用和疗效稳定性。

组别Bax/Bcl-2LC3B/GAPDHBeclin-1/GAPDH正常对照组1.00±0.031.00±0.111.00±0.12高脂模型组3.13±0.40∗1.29±0.09∗1.47±0.10∗当归补血汤低剂量组1.76±0.26△0.99±0.10△1.20±0.10△当归补血汤高剂量组1.31±0.18△0.87±0.02△0.94±0.23△罗格列酮对照组2.35±0.46∗1.09±0.431.08±0.46

*与正常对照组比较P<0.05; △与高脂模型组比较P<0.05

过多的油脂摄入将导致机体内大量的脂质堆积和ROS积累，而ROS能攻击生物体内的多不饱和脂肪酸而引起生殖细胞中脂质过氧化和线粒体损伤，导致睾丸精子发生和类固醇生成功能障碍[8]，进而影响雄性生物精子浓度与精子活力明显降低，精子畸形率增高，同时伴有血睾屏障的破坏[9]。现代药物化学研究表明当归补血汤中富含总多糖、毛蕊异黄酮、芒柄花素、黄芪甲苷、藁本内酯、当归多糖、阿魏酸等物质，具有显著的抗氧化功能。阿魏酸是姜黄素的衍生物，具有类似姜黄素的抗氧化功能，可以降低机体内MDA水平、提高SOD含量，进而发挥其对机体的治疗保护作用[10-11]。本研究结果显示高脂模型组睾丸组织中MDA含量显著升高而SOD活力下降，给予当归补血汤治疗可使睾丸组织MDA水平明显下降而SOD活力显著提高，提示当归补血汤可能通过改善氧化应激从而有效地恢复雄性个体生育能力。

大量的研究已证实氧化应激可介导细胞凋亡发生。细胞凋亡主要由凋亡诱导基因Bax和凋亡抑制基因Bcl-2共同调控，Bax/Bcl-2 比例失衡可激活下游Caspase信号通路从而诱导凋亡的发生，最终引发生精功能的障碍。高脂饮食可致睾丸促凋亡蛋白Bax和Cleaved-Caspase3表达升高，而Bcl-2表达降低，睾丸细胞凋亡增加。本研究与穆杨等[12]研究结果相符，高脂模型组睾丸组织中Bax/Bcl-2比值增加，当归补血汤治疗与罗格列酮相比更显著降低其比值，表明当归补血汤可能通过改善氧化应激抑制睾丸细胞凋亡发生。

自噬是真核细胞中发生的一个自我清除过程，正常的自噬过程可以帮助生物体内细胞的生长平衡，特别是对因高血糖和缺氧引起的睾丸损伤具有保护作用[13]。然而异常自噬被认为参与了诸多相关疾病的发病进程，自噬不足或过度自噬将导致生殖细胞退化，同时会降解线粒体或内质网等细胞器从而破坏睾丸的稳态，影响睾丸的生长发育及其发挥正常的生理功能[14]。研究发现动物长期高脂饮食将引起细胞氧化/抗氧化平衡失调，ROS的产生将抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1并导致自噬相关基因4因氧化而失活，使得自噬相关基因8产生脂化在细胞内形成自噬体而诱导自噬[15-16]。本实验发现高脂模型组的大鼠睾丸组织中自噬相关蛋白Beclin-1和LC3B表达增加，表明高脂饮食将诱导细胞自噬发生，而给予当归补血汤治疗后大鼠睾丸组织自噬相关蛋白表达水平明显下降，相比于罗格列酮修复线粒体功能更好。

综上所述，高脂饮食可导致大鼠生精功能障碍、氧化应激、自噬以及凋亡水平增加。当归补血汤通过提高大鼠抗氧化能力、抑制自噬以及凋亡发生从而保护大鼠睾丸组织结构与功能，深入研究当归补血汤对高脂饮食人群睾丸功能的保护作用将为临床防治生殖功能损伤提供新的解决思路。