郑建伟，曹李，康春博#

1航天中心医院普通外科，北京100049

2解放军总医院普通外科，北京100853

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，约占全部女性恶性肿瘤的18%，发病率居女性恶性肿瘤第一位，病死率居女性恶性肿瘤第二位[1]。乳腺癌术前行新辅助化疗可以减少肿瘤微转移，降低肿瘤分期，提高手术切除率及保乳率。化疗是三阴性乳腺癌[雌激素受体（estrogen receptor，ER）阴性，孕激素受体（progestrogen receptor，PR）阴性，人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）阴性]的主要治疗手段，对患者进行新辅助化疗，可实现降期保乳的目标。肿瘤患者的免疫功能与肿瘤的发生、发展、转移、疗效密切相关，随着分子生物学和免疫学的发展，细胞免疫治疗成为乳腺癌治疗研究的新热点[2]。细胞免疫在肿瘤免疫中占有主导作用，尤其是T细胞的功能对于肿瘤的免疫监测具有关键意义。淋巴细胞亚群水平是评价免疫功能的重要手段[3]，能够总体反映机体当前的免疫功能状态。三阴性乳腺癌较其他类型乳腺癌有更强的免疫原性，因此本研究采用流式细胞术分析早期三阴性乳腺癌患者新辅助化疗前后外周血T淋巴细胞亚群变化，进一步探讨T淋巴细胞亚群对新辅助化疗的疗效预测作用，为三阴性乳腺癌患者新辅助化疗的决策提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2016年1月至2018年12月于解放军总医院普通外科进行新辅助化疗的女性三阴性乳腺癌患者的病历资料，作为病例组。纳入标准：行新辅助化疗前均经穿刺病理证实为浸润性乳腺癌，且均有可测量的乳腺癌病灶，均无化疗禁忌证。排除标准：患者无病理诊断结果或非三阴性乳腺癌。根据纳入、排除标准，共纳入三阴性乳腺癌患者44例，年龄38～65岁，中位年龄为52岁；美国癌症联合会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）肿瘤分期：Ⅱ期30例，Ⅲ期14例；浸润性导管癌42例，浸润性小叶癌1例，髓样癌1例。选取同期行健康体检的12例女性为对照组，年龄35～65岁，中位年龄为52岁。两组研究对象的年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 化疗方法

病例组患者采用表柔比星/多柔比星（EC/AC）序贯紫杉类（T）化疗方案：表柔比星/多柔比星90/60 mg/m2，第1天，静脉注射；环磷酰胺600 mg/m2，第1天，静脉滴注；3周为1个周期，4个周期为一个疗程；序贯多西他赛75～80 mg/m2或紫杉醇175 mg/m2，第1天，静脉滴注；3周为1个周期，4个周期为一个疗程。

1.3 检测方法

病例组患者于新辅助化疗前及化疗8个周期后（未完成8个周期进展患者在进展时）评价疗效时抽取外周静脉血2 ml，肝素抗凝，各取 100 μl，分别加入鼠抗人CD3、CD4、CD8、CD16、CD28、CD25、CD56荧光标记的单克隆抗体20 μl，闭光孵育30 min，加入磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）3 ml洗涤，1500 r/min离心5 min，弃上清液，加入PBS 1 ml混匀，上机检测CD3+、CD3+/CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+、CD8+CD28+、CD3-CD16+CD56+自然杀伤（nature killer，NK）细胞比例，淋巴细胞亚群以中位值作为界值。单克隆抗体及流式细胞仪均购自美国BD公司，按试剂说明操作。对照组患者于健康体检时留取外周静脉血检测，方法同病例组。

1.4 疗效评价标准

采用实体瘤疗效评价标准1.1版（response evaluation criteria in solid tumors 1.1，RECIST 1.1）[4]评估患者的疗效：完全缓解（CR），所有目标病灶完全消失；部分缓解（PR），基线病灶长径总和缩小≥30%；疾病进展（PD），基线病灶长径总和增加≥20%或出现新的病灶；疾病稳定（SD），基线病灶长径总和缩小但未达PR或增加未达PD。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法；影响因素分析采用Logistic多因素回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 新辅助化疗前病例组及对照组研究对象T淋巴细胞亚群比例的比较

新辅助化疗前，病例组患者CD3+、CD3+CD8+及CD4+CD25+比例均高于对照组，CD8+CD28+比例低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。两组研究对象CD3+CD4+、CD3-CD16+CD56+NK细胞比例比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

表1 化疗前病例组及对照组研究对象T淋巴细胞亚群比例的比较

2.2 新辅助化疗前后病例组患者T淋巴细胞亚群比例的比较

新辅助化疗后，病例组患者CD3+和CD3+CD8+比例均提高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；新辅助化疗前后病例组患者其他指标比例比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

表2 新辅助化疗前后病例组患者T淋巴细胞亚群比例的比较（%，±s）

表2 新辅助化疗前后病例组患者T淋巴细胞亚群比例的比较（%，±s）

注：*与化疗后比较，P＜0.05

CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD4+CD25+CD8+CD28+CD3-CD16+CD56+NK 61.9±9.5*34.2±9.5 25.5±3.5*2.8±0.3 10.9±1.5 17.6±9.5 65.6±8.8 34.8±7.8 29.5±8.8 2.7±1.2 12.8±5.9 17.3±8.1化疗前化疗后

2.3 不同临床特征的三阴性乳腺癌患者疗效的比较

CD8+CD28+比例≥12.5%的三阴性乳腺癌患者疗效明显优于CD8+CD28+比例＜12.5%的患者，差异有统计学意义（χ2=9.402，P=0.002）；不同年龄、病理类型、AJCC分期、淋巴结数目、组织学分级、Ki-67 及 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+、CD3-CD16+CD56+NK细胞比例的三阴性乳腺癌患者的疗效比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表3）

表3 不同临床特征的三阴性乳腺癌患者的疗效

2.4 三阴性乳腺癌疗效影响因素的Logistic多因素回归分析

进一步将CD8+CD28+T细胞（＜12.5%=1，≥12.5%=2）纳入Logistic多因素回归模型，发现CD8+CD28+T细胞比例仍为三阴性乳腺癌患者新辅助化疗疗效的影响因素（OR=1.361，95%CI=1.015～1.825，P=0.039）。

3 讨论

化疗是乳腺癌的重要治疗手段。随着化疗疗效的提高及乳腺癌患者生存时间的延长，化疗对于肿瘤的其他作用越来越受到关注[5-6]。机体的免疫功能下降在肿瘤发生、发展及转移中发挥了重要作用[7]。越来越多的证据表明，免疫功能与抗体药物疗效相关，如曲妥珠单抗[8]，而且与日益发展的免疫治疗疗效密切相关[9]。因此，化疗对于免疫功能的影响越来越受到重视。

细胞免疫在肿瘤免疫中占有主导地位，尤其是T细胞的功能对于肿瘤的免疫监测具有关键意义。淋巴细胞亚群是分析免疫功能的重要手段[3]，CD3+细胞为总T细胞，根据功能又可将其分为CD4+和CD8+等亚群，CD4是辅助性T淋巴细胞的表面抗原，CD4+细胞不能直接识别肿瘤细胞，也不能直接杀伤肿瘤细胞，而是把相关的肿瘤抗原呈递给相应的效应细胞，从而特异性地激发活化的细胞发挥抗肿瘤作用。CD8+细胞为具有负调节效应的抑制性T淋巴细胞，可引起细胞裂解及介导靶细胞凋亡，从而特异性地直接杀伤肿瘤细胞[10]。CD4+CD25+可通过细胞接触依赖机制或抑制性细胞因子依赖机制主动抑制自身反应性T细胞的活化，维持自身耐受，影响免疫系统对肿瘤的应答。NK细胞属于非特异性免疫细胞，无主要组织相容性复合体限制，不依赖抗体，主要是通过分泌各种细胞毒因子直接杀伤靶细胞，在体内具有免疫监视功能，对肿瘤的生长及转移具有抑制作用。

既往研究报道，在肿瘤患者外周血中可检测到CD8+细胞比例升高，而 CD3+、CD4+、CD4+CD8+、NK细胞比例均下降[11-12]。肿瘤细胞可产生免疫抑制因子，抑制淋巴细胞分化增殖，导致CD4抗原减少，CD8+细胞反应性增多，而增多的抑制性CD8+细胞又反过来抑制CD4+细胞，从而导致CD4+CD8+下降甚至倒置。随着肿瘤的进展，产生和分泌的抑制因子会越来越多，诱导CD8+细胞产生的同时也阻止 CD4+细胞的产生[13-15]。

本研究中病例组患者CD3+、CD3+CD8+及CD4+CD25+比例均高于对照组，CD8+CD28+比例低于对照组，均表明患者免疫功能紊乱。淋巴结转移的患者细胞免疫明显受到抑制，随着疾病的进展，机体免疫功能逐渐降低[16]。

调节性T细胞是一个高度异质性的群体，通过分泌各种不同的可溶性因子和直接接触介导免疫抑制作用[17-18]。肿瘤患者外周血和肿瘤局部调节性T细胞均明显升高，升高的调节性T细胞与肿瘤高负荷及不良预后相关[19-20]。既往关于调节性T细胞的报道尚不一致。早期的研究发现浸润性乳腺癌患者中，分期晚者调节性T细胞比例高[21]。而Sakaguchi[22]研究发现不同临床分期的乳腺癌患者调节性T细胞比例无差异，而调节性T细胞比例高预示患者预后不良。

有效的新辅助化疗可以降低肿瘤分期，缩小原发癌灶，提高手术率及保乳率，还可以抑制原发病灶和微小转移灶，降低术后复发率，并提高生存率。经过有效的治疗后，免疫功能可恢复[23]。本研究中44例三阴性乳腺癌患者新辅助化疗后CD3+和CD3+CD8+比例均提高，而CD4+CD25+T细胞、CD8+CD28+T细胞均无显著变化，提示患者化疗对于患者细胞免疫功能无明显抑制作用。。

在进一步探索患者临床特征与新辅助化疗疗效关系的研究中发现，CD8+CD28+比例≥12.5%的三阴性乳腺癌患者疗效明显优于CD8+CD28+比例＜12.5%的患者，进一步证明了患者免疫功能与化疗疗效的关系。化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，对机体的免疫系统也产生了显著的影响[24]。传统观点认为化疗杀伤了免疫细胞，导致免疫细胞数量下降[25]，而进一步深入研究发现，不同的化疗药物可引起不同的免疫效应，紫杉类药物可显著提高血清白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）的水平，刺激免疫效应细胞增生，产生抗肿瘤的效果[26]。Melichar等[27]报道 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+水平在多柔比星联合紫杉醇的化疗过程中明显升高。

综上所述，本研究进一步证实了三阴性乳腺癌患者存在免疫功能失调，外周血淋巴细胞亚群水平能客观地反映患者机体的细胞免疫功能状态，监测三阴性乳腺癌患者外周血淋巴细胞亚群水平对于新辅助化疗疗效预测具有一定的参考价值。