逯冉冉 耿建红 张群英 付文玉 赵敏

(潍坊医学院 1神经病学教研室，山东 潍坊 261053；2组织与胚胎学教研室)

研究表明，脑缺血再灌注(I/R)损伤机制是一系列复杂的病理生理过程，急性脑I/R可导致严重的迟发性脑神经元损伤，可能是由于缺血再灌注周围脑组织发生炎症反应和细胞凋亡，加剧了脑组织水肿和神经元的进一步损伤〔1,2〕。丁苯酞(NBP)是从芹菜籽中提取而来的有效成分，广泛用于治疗各种脑血管病。临床研究发现，NBP在全面治疗缺血性脑卒中有明显减少梗死后神经功能缺失、改善患者生活能力状态的作用〔3〕，但NBP对脑I/R大鼠神经元具体保护机制尚未十分明确。本实验通过建立局灶性脑I/R大鼠模型检测各组含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)3、caspase8、β-连环蛋白(catenin)蛋白表达量，星型胶质细胞的数量和形态改变，从而探讨NBP的神经元的保护作用。

1 材料与方法

1.1材料 NBP注射液(石药集团恩必普药业有限公司生产提供)，主要试剂包括caspase3、caspase8(Life Science试剂公司)、β-catenin(CST试剂公司)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)多克隆抗兔(abcom试剂公司)。

1.2实验动物分组及处理 动物选取清洁级健康的成年雄性SD大鼠60只，体重250～280 g，青岛大任富城畜牧有限公司提供。动物每笼3～4只饲养，室温维持在(23±2)℃，自由摄水摄食。将大鼠随机分为4组：假手术(Sham)组、模型(I/R)组、BNP低剂量(NBP1)组、NBP高剂量(NBP2)组。

1.3动物模型的制备 参照Longa等〔4〕线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞(MACO)的局灶性脑缺血模型。经腹腔注射10%水合离醛麻醉大鼠。使其仰卧位置于手术操作台上，颈部正中切口钝性分离颈下皮肤肌肉，充分暴露一侧的颈部动脉。分离颈内外动脉，结扎颈外血管，将鱼线由颈总动脉插入颈内血管到达大脑中动脉。鱼线至颈内外分叉口18 mm，结扎颈总动脉。检查无出血后，依次缝合颈部组织和皮肤，1.5 h后拔出栓线，放置笼中观察直至清醒，并正常饲养。NBP1组和NBP2组大鼠分别在术后6 h、12 h、24 h腹腔注射BNP溶液(4 mg/kg、6 mg/kg)，Sham组和I/R组注射等量生理盐水。

1.4大鼠行为学评分及脑组织含水量测定 大鼠再灌注24 h后进行神经功能评分，参照文献〔5〕评分标准：0分，无神经功能缺损症状；1分，轻微神经功能缺损，不能完全伸展向对侧前爪；2分，重度局灶性神经功能缺损，向对侧转圈；3分，重度局灶性神经功能缺损，向对侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。评分后将大鼠立即断头处死，取缺血侧脑组织迅速称其湿重，然后置于100℃高温烤箱内，烘干48 h后称其干重。按照Elliott公式，计算脑含水量，脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.5免疫荧光组织化学染色 各组SD大鼠缺血再灌注24 h后每组随机选取5只，用10%水合氯醛进行腹腔麻醉。由左心室进针入升主动脉剪开右心耳，生理盐水200 ml快速冲净血液，4%多聚甲醛的磷酸缓冲液(PBS)400 ml缓慢灌注固定后取脑；将脑组织依次放置浓度为20%、30%蔗糖溶液梯度沉糖脱水2次。包埋剂包埋脑组织，冰冻切片机切片厚度10 μm；采用过氧化物酶标记的链霉卵白素(SP)法进行免疫组化染色，冰冻切片室温下复温20 min，PBS洗涤3次×5 min，山羊血清封闭30 min，滴加一抗4℃过夜，次日复温30 min，PBS洗涤3次×5 min；荧光二抗避光孵育1 h，PBS避光洗涤3次×5 min，Hoechest33258避光染色30 min，PBS避光洗涤3次，抗免疫荧光剂封片。在荧光显微镜400倍视野下，采集拍照；采用 Image Pro Plus 6.0图像分析软件对结果进行定量分析，测定平均光密度值(IOD)进行统计学分析。

1.6Western印迹检测蛋白水平 各组大鼠缺血再灌注24 h后，麻醉断头处死，迅速取出缺血侧脑皮质。 加入蛋白组织裂解液冰上研磨匀浆，提取各组样本的总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法进行蛋白定量，将各组蛋白终浓度调整一致。采用十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)垂直板全湿法电泳，上样，电泳，将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，放入含 5%脱脂牛奶的TBST封闭缓冲液中封闭2 h后加入稀释的一抗(1∶1 000)。一抗4℃摇床孵育过夜，室温下复温1 h，充分洗膜后加入二抗(1∶5 000)室温孵育1 h，洗膜后发光液化学发光，使用胶片进行曝光。

1.7统计学方法 应用SPSS19.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组β-catenin、caspase3、caspase8蛋白表达 各组皮质区均能检测到β-catenin、caspase3、caspase8蛋白条带。I/R组caspase3、caspase8的蛋白表达量明显高于Sham组，而β-catenin却显著低于Sham组(P<0.05)。NBP1组和NBP2组与I/R组相比，明显下调了β-catenin蛋白，降低了caspase3、caspase8蛋白的表达量(P<0.05)。NBP2组与NBP1相比caspase3、caspase8蛋白显著降低，β-catenin显著上调(P<0.05)，见图1、表1。

组别Caspase3Caspase8β-cateninSham组0.03±0.040.10±0.050.93±0.11I/R组0.24±0.071)0.42±0.091)0.59±0.0081)NBP1组0.17±0.052)0.33±0.062)0.66±0.0062)NBP2组0.13±0.082)3)0.26±0.072)3)0.75±0.072)3)

与Sham组比较：1)P<0.05；与I/R组比较：2)P<0.05；与NBP1组比较:3)P<0.05；下表同

2.2神经功能评分和脑水肿含水量测定 Sham组未观察到任何神经功能损伤，NBP1组及NBP2组评分明显低于I/R组，且NBP2组显著低于NBP1组(P<0.05)。NBP1组及NBP2组脑含水量均显著低于I/R组(P<0.05)，且NBP2组显著低于NBP1组(P<0.05)。见表2。

表2 各组行为学评分及脑组织含水量比较

2.3NBP对神经元细胞的影响 I/R组星型胶质细胞肥大，增生，胞核深染，呈过度激活状态。NBP1组及NBP2组星型胶质细胞仅少量细胞激活，随着剂量增加细胞激活量降低，两组激活程度均显著低于I/R组(P<0.05)。I/R组大部分细胞出现凋亡，细胞核变小，核染色质高度凝集甚至破碎，呈强亮色荧光；NBP1组及NBP2组强荧光细胞即凋亡细胞数量明显减少(P<0.05)。见表3、图2。

表3 各组GFAP和Hoechest染色积分光密度(IOD)值比较

图2 大鼠脑缺血再灌注24 h后各组星型胶质细胞激活状态和细胞核破碎程度表达(×400)

3 讨 论

研究发现，NBP在阿尔茨海默病和脑卒中动物模型中都具有显著的神经保护作用〔6，7〕。BNP治疗缺血性脑卒中作为一个多目标神经保护活性剂，通过减少氧化损伤和抑制炎症反应，显著改善线粒体功能减少神经元凋亡〔8〕。目前NBP已广泛应用于临床治疗脑卒中患者并有显著成效，NBP不仅能够改善患者急性脑损伤而且可以改善脑卒中后导致行走、肢体运动方面的残疾及感觉、语言和记忆力等〔9,10〕。

当脑组织血流中断后依次会导致氧化应激和炎症反应，最终引起神经元死亡，当缺血一定时间后再灌注会进一步加剧凋亡程度〔11〕。细胞凋亡是脑I/R损伤最严重结果，其中caspase基因家族中的caspase3和caspase8在细胞凋亡的发生发展中起重要作用〔12〕。研究表明在短暂局灶性脑缺血大鼠中 β-catenin表达下降，影响细胞周期的调节〔13〕。β-catenin蛋白对神经元和中枢神经系统的发育起重要作用，在胚胎发育过程中Wnt蛋白主要通过调节β-catenin控制基因转录和激活〔14〕。同时有研究发现β-catenin在细胞凋亡中发挥重要作用，其中主要是通过Wnt/β-catenin信号通路调节细胞增殖、裂解及细胞间的极性和连接〔11〕。当β-catenin突变的胚胎发育过程中去除β-catenin基因可诱发凋亡，导致神经脊细胞、感觉神经元、背根神经节、后脑等组织的损伤〔15，16〕。此外，结肠腺瘤样息肉病基因(APC)作用于β-catenin，降解清除β-catenin后导致核内转录因子T细胞因子(TCF)/淋巴细胞增强因子(LEF)的转活减少，当TCF/LEF失活后APC基因可进一步诱导caspase3、caspase7和 caspase8的激活及增强聚合酶(PARP)分裂导致细胞凋亡易发性〔17〕。

本实验研究发现大鼠脑I/R 24 h后BNP组行为学评分和脑水肿程度均低于I/R组，进一步证实NBP对大鼠脑I/R损伤有显著保护作用。NBP预处理后上调了β-catenin表达量，降低了细胞激活和凋亡的程度，并随着浓度的升高保护作用加强。

综上所述，NBP可能是通过上调 β-catenin蛋白表达，同时减弱APC基因对caspase3和caspase8的活化，来降低星型胶质细胞过度激活和神经元细胞的凋亡，从而对脑I/R大鼠神经元损伤和细胞凋亡起到保护作用。