钟玉君 陈振锋 梁 宏

(广西师范大学化学与药学学院，省部共建药用资源化学与药物分子工程国家重点实验室，桂林 541004)

化疗是治疗癌症的重要手段之一，在Rosenberg等发现顺铂的抗肿瘤活性后，人们合成了许多顺铂类似物并应用于临床。至今，铂类药物仍是应用最广泛的化疗药物[1-2]。但由于铂类药物的耐药性和严重的副作用，如急性肾毒性、骨髓抑制和慢性神经毒性[3-4]，促使人们寻找新的非铂类抗肿瘤金属配合物[5]。

铜在人体内的含量仅次于铁和锌，并且参与生物体中几个关键的生命过程[6]。一般来说，铜的毒性比其他金属小，因此，铜（Ⅱ）配合物被认为具有克服毒副作用和耐药性的特性。许多铜（Ⅱ）配合物被报道具有较强的结合与裂解DNA的能力，其中一些具有抗癌和调控凋亡的能力[7-9]。三联吡啶及其衍生物可以作为DNA结合剂、拓扑酶抑制剂和抗肿瘤药物，具有潜在的应用价值[10-11]。此外，三联吡啶作为一种三齿配体，有3个共平面的氮原子，具有与金属形成稳定金属配合物的能力，是构建金属配合物的重要配体[12,14-15]。

为此，我们合成了1个新的三联吡啶铜（Ⅱ）配合物[Cu2(μ-L-κO，O)2Cl2](1)，通过单晶 X 射线衍射确定了配合物1的晶体结构，测定了配合物1对5种肿瘤细胞株(MGC80-3、T24、A549、HeLa、Hep-G2)的体外抗肿瘤活性，应用流式细胞术测定了配合物1对MGC80-3细胞的凋亡效应及周期阻滞情况。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

所用仪器有：Bruker APEX-Ⅱ CCD单晶衍射仪，德国Bruker AvanceⅢHD 400 MHz核磁共振谱仪，德国Bruker HCT离子阱质谱仪，美国Spectrum Two傅里叶变换红外光谱仪，德国Vario ELⅢ元素分析仪，美国CARY ECLIPSE紫外可见分光光度计，美国Thermo二氧化碳培养箱，美国TECANM1000酶标定量测定仪，美国BD公司FACSVerse流式细胞仪。

3-氯水杨醛、2-乙酰吡啶及氯化铜均为分析纯试剂，购于阿拉丁。胎牛血清及DMEM培养基购自CIBCO公司，MTT购自Solarbio公司。

1.2 配体及配合物的合成与结构表征

配体 4-(2-羟基-3-氯)苯基-2，2′∶6′，2″-三联吡啶(HL)的合成参考文献已报道的方法[13]，产率为81.7%。用3-氯水杨醛和2-乙酰吡啶反应合成配体(HL)(Scheme 1)。其结构表征数据为：ESI-MSm/z：397.5[L+K+]。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ15.57(s，1H)，9.08(d，J=1.3 Hz，1H)，8.89(d，J=1.3 Hz，1H),8.84(d，J=4.8 Hz,2H),8.48(d，J=8.0 Hz,1H),8.32(s,1H)，8.23(d，J=7.9 Hz，1H)，8.13(s，1H)，8.06(d，J=17.3 Hz，1H)，7.57(s，2H)，7.56(d，J=9.2 Hz，1H)，7.00(s，1H)。13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)：δ155.54，155.42，150.65，150.50，149.79，148.10，137.90，130.83,129.48,129.10,124.89，122.65，121.59，121.30。 IR(KBr，cm-1)：3 910(w)，3 889(w)，3 808(w)，3 786(w)，3 697(w)，3 659(w)，3 636(w)，3 574(w)，3 055(m)，3 010(m)，1 693(w)，1 585(s)，1 566(s)，1 547(s)，1 468(s)，1 436(s)，1 391(s)，1 263(m)，1 228(m)，1 177(m)，1 140(m)，1 080(m)，1 042(m)，991(w)，890(m)，867(m)，829(w)，775(s)，737(s)，665(m)，637(m)，621(m)，564(w)，510(w)。

Scheme 1 Synthesis of ligand HL

配合物[Cu2(μ-L-κO，O)2Cl2](1)的合成方法如下：称取10 mg(0.028 mmol)配体和10 mg(0.056 mmol)CuCl2·2H2O于一端闭合的25 cm Pyrex厚壁玻璃管中，滴加0.25 mL丙酮与1 mL甲醇，液氮冷冻后，在真空条件下将玻璃管开口端熔封，待玻璃管内溶液恢复室温后置于65℃的烘箱反应72 h。反应结束后梯度降温至室温，管内生成墨绿色块状晶体(配合物1)，产率为62.7%。挑选出大小、形状适合的单晶，进行结构表征。配合物1的晶体学及结构修正数据见表1。其结构表征数据如下：ESI-MS m/z：498.6[M-Cu-L-Cl+K+H]+。 元素分析按 C42H26Cl4Cu2N6O2计算值(%)：C 55.10，H 2.86，N 9.18；实测值(%)：C 54.87，H 2.89，N 9.15。IR(KBr，cm-1)：3 909(w)，3 890(w)，3 858(w)，3 843(w)，3 826(w)，3 807(w)，3 787(w)，3 738(w)，3 715(w)，3 695(m)，3 680(w)，3 659(w)，3 635(w)，3 572(m)，3 433(m)，3 057(m)，2 344(w)，1 604(s)，1 569(m)，1 554(m)，1 475(s)，1 450(m)，1 414(s)，1 325(m)，1 301(m)，1 246(s)，1 164(m)，1 138(m)，1 093(m)，1 067(m)，1 052(w)，1 036(m)，1 019(s)，890(m)，870(m)，783(s)，749(m)，736(m)，715(m)，680(m)，656(m)，645(m)，510(w)，414(w)。

1.3 配合物1晶体结构测定

挑选出大小、形状适合的单晶置于Bruker APEX-ⅡCCD单晶衍射仪上，采用经石墨单色器单色化的 Mo Kα 射线(λ=0.071 073 nm)，在 296.15 K下,2.417°～29.601°(θ)范围内对配合物 1 的单晶 X 射线衍射数据进行收集。晶体结构使用具有各向异性热参数的SHELXL-2015[16]的直接方法解出并通过全矩阵最小二乘法 (the full-matrix least-squares method on F2)进行精修。碳原子上的氢原子为理论加氢。配合物1的部分晶体学及结构修正数据见表1。

CCDC：1959094。

表1 配合物1的晶体学及结构修正数据Table 1 Crystal data and structure refinement for complex 1

1.4 体外抗肿瘤活性实验

采用MTT比色法测定CuCl2·2H2O、配体HL、配合物1及顺铂对所选5种癌细胞株(MGC80-3、T24、A549、HeLa、Hep-G2)的 IC50值。 使用流式细胞术检测配合物1诱导MGC80-3细胞凋亡以及周期阻滞的情况。

2 结果与讨论

2.1 配合物1的晶体结构

配合物1的晶体结构如图1所示，部分键长和键角数据详见表2。配合物1属于三斜晶系，P1空间群。配合物1为双核结构，在对称单元中，中心铜（Ⅱ）离子为五配位扭曲四方锥几何构型，每个铜离子与1个Cl-以及来自配体L-的2个N原子和2个羟基O原子配位；2个铜（Ⅱ）离子通过羟基的桥联形成双核结构。

2.2 配合物1在溶液中的稳定性

用紫外光谱检测配体HL和配合物1的稳定性(图 2、3)。 浓度为 20 μmol·L-1的配合物在 pH=7.35的Tris-HCl缓冲液中，置于室温下0和48 h后，分别用紫外光谱仪各测1次吸光度[17-18]。从图中可以看出各组吸收峰没有发生红移或蓝移现象，也没有新的吸收峰出现，说明配合物1在Tris-HCl缓冲液中能够稳定存在至少48 h。

图1 配合物1的椭球率50%的晶体结构图Fig.1 Crystal structure of complex 1 with 50%probability ellipsoids

表2 配合物1部分键长(nm)和键角(°)Table 2 Selected bond lengths(nm)and angles(°)for complex 1

图2 配体HL的紫外光谱图Fig.2 UV spectra of ligand HL

图3 配合物1的紫外光谱图Fig.3 UV spectra of complex 1

2.3 体外抗肿瘤活性

为了研究配合物1的体外抗肿瘤活性，我们以人正常肝细胞HL-7702为对照，采用MTT法测定了 CuCl2·2H2O、 配体 HL、配合物 1和顺铂对MGC80-3，T24，A549，HeLa 和 Hep-G2 五种肿瘤细胞株的细胞毒性[19-22]。由表3可知，配合物1对所选的肿瘤细胞株的抑制率均高于CuCl2·2H2O、配体HL及顺铂。其中对人胃癌MGC80-3细胞的抑制率最高，达到了(84.30±1.28)%。如表4所示，从IC50也可以看出，配合物1对人胃癌MGC80-3细胞的细胞毒性最高，其 IC50值为(3.36±0.43)μmol·L-1。 与正常细胞HL-7702相比，配合物1对5种肿瘤细胞均表现出较高的细胞毒性，说明配合物1在一定程度上可以选择性抑制肿瘤细胞。

表3 化合物对不同细胞株的抑制率Table 3 Inhibition rates of ligand HL,CuCl2·2H2O,complex 1 and cisplatin on the six selected human cell lines%

表4 化合物对不同细胞株的IC50值Table 4 IC50 values of ligand HL,CuCl2·2H2O,complex 1 and cisplatin on the six selected human cell lines μmol·L-1

2.4 细胞凋亡

采用Annexin V FITC和PI双染色法测定配合物1对MGC80-3细胞的凋亡效应。图4为药物浓度分别为 1.5、3.0 和 4.5 μmol·L-1，作用 24 h 后，配合物1诱导人胃癌MGC80-3细胞凋亡的百分数。在给药浓度4.5μmol·L-1下，细胞凋亡百分数为41.4%，比对照组增加了33.45%，可推测配合物1诱导MGC80-3细胞进入早期凋亡[23]。

图4 配合物1诱导MGC80-3凋亡的情况Fig.4 Apoptosis in MGC80-3 cells exposure to complex 1 for 24 h

2.5 周期阻滞

图5 配合物1对MGC80-3细胞周期的影响Fig.5 Cell cycle distribution of MGC80-3 cells exposure to complex 1 for 24 h

采用流式细胞术研究了配合物1诱导MGC80-3细胞的细胞周期阻滞情况[24-25]。图5为不同浓度下，配合物1作用MGC80-3细胞24 h后的细胞周期阻滞情况。与空白对照组相比，随着给药浓度从1.5、3.0、4.5 μmol·L-1逐渐增大，MGC80-3 细胞在G1期的百分比明显增加，由43.81%分别增至72.14%、72.68%和74.19%，呈浓度依赖关系。说明配合物1使MGC80-3细胞阻滞于G1期，从而抑制肿瘤细胞的生长。

3 结 论

以 4-(2-羟基-3-氯) 苯基-2，2′∶6′，2″-三联吡啶(HL)作为配体合成了配合物[Cu2(μ-L-κO，O)2Cl2](1)，并用多种分析方法对其进行完整的表征。采用MTT法、流式细胞术对5种肿瘤细胞株及人正常肝细胞HL-7702进行抑制生长活性、细胞凋亡和细胞周期阻滞测试。与配体和顺铂相比，配合物1对不同的细胞株具有更高的细胞毒性，其中对人胃癌MGC80-3细胞的细胞毒性最高，IC50值为(3.36±0.43)μmol·L-1。 配合物 1可以诱导 MGC80-3细胞凋亡，且配合物1使MGC80-3细胞阻滞于G1期。