杨新周， 吴 娜， 邱晓雪

(1.德宏师范高等专科学校 理工学院, 云南 德宏 678400； 2.红河学院 理学院， 云南 蒙自 661199； 3.德宏师范高等专科学校 民族医药研究所, 云南 德宏 678400)

白花蛇舌草(HedyotisdiffusaWilld)又叫蛇舌草、蛇总管、蛇痢草、二叶等，属茜草科(Rubiaceae)耳草属植物[1]，分布于世界各地，在我国主要产自福建、广东、香港、广西、海南、安徽、云南等省区，有清热解毒、活血止痛、利尿消肿等功效。临床上用于治疗咽喉肿痛、阑尾炎、毒蛇咬伤、盆腔炎、尿路感染、小便不利、菌痢等病症[2]。白花蛇舌草中主要含有无机元素、多糖类、三萜类、有机酸类、黄酮类、蒽醌类、烷烃类、甾醇类、环烯醚苷萜类、生物碱等化学成分，也含有一些微量元素、氨基酸及挥发性成分[3-4]。其中，齐墩果酸和熊果酸是其主要药用成分，具有显著的抗菌、消炎、抗癌、抗突变、抗氧化等药理作用[5]。有关白花蛇舌草的研究主要集中在成分组成、药理活性以及有效成分提取等方面。近年来为了进一步开发白花蛇舌草，使其在临床上得到更合理充分的利用，对其中熊果酸和齐墩果酸含量测定方法的研究越来越受到重视，越来越多的学者研究不同方法同时测定两种物质的含量[5-8]。高效液相色谱法是检测白花蛇舌草中齐墩果酸和熊果酸含量最常用的方法[6-7,9-10]。由于齐墩果酸和熊果酸互为同分异构体，结构、性质非常相似，难以分离。近年来虽然广泛用高效液相色谱法进行测定，但是由于流动相组成复杂，出峰时间长，峰形和分离度均不够理想，从而影响分析结果的准确性，分离及含量分析还需进一步深入探究。为此，笔者等以乙醇为溶剂结合超声波提取进行样品前处理，通过改变优化色谱条件，建立分离效果较好的高效液相色谱分析方法，并用该法测定云南不同产地白花蛇舌草中齐墩果酸和熊果酸的含量，以期为白花蛇舌草的质量控制奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

药材：白花蛇舌草样品，采集于云南省不同地区，经德宏师范高等专科学校鉴定为茜草科耳草属植物白花蛇舌草，其详细信息见表1。

表1 白花蛇舌草样品采集信息

仪器：高效液相色谱仪( Agilent 1100)，超声波清洗器(SK7200LHC，上海科导超声仪器有限公司)，色谱柱ZORBAX Eclipse XBD-C18柱(4.6×150 mm, 5 μm)，恒温水浴锅(B-260，上海亚荣生化仪器厂)，旋转蒸发仪(N-1100，上海爱朗仪器有限公司)，电子天平(CP224C，奥豪斯仪器上海有限公司)。

试剂：齐墩果酸、熊果酸标准品(北京普天同创生物科技有限公司)，色谱纯甲醇和乙腈、冰乙酸(GR)、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氢氧化钾等为分析纯，娃哈哈纯净水。

1.2方法

1.2.1样品的制备将采集的样品自然阴干，粉碎，过0.3 mm孔径筛子，保存备用。

1.2.2高效液相色谱检测条件的优化

1) 流动相的选择。在液相色谱柱温为20℃，进样量30 μL，流速1 mL/min条件下，分别考察甲醇-2%冰乙酸水溶液(88∶12)、甲醇-3%冰乙酸水溶液(88∶12)、乙腈-2%冰乙酸水溶液(60∶40)、乙腈-磷酸钾盐缓冲液(pH 8左右)(60∶40)等流动相对分离效果的影响。

2) 柱温的选择。以甲醇-2%冰乙酸(88∶12)为流动相，进样量30 μL，流速1 mL/min，考察柱温分别为35℃、30℃、25℃和20℃时的分离效果。

3) 进样量的选择。以甲醇-2%冰乙酸(88∶12)为流动相，色谱柱温20℃，流速1 mL/min，考察进样量分别为20 μL、30 μL和50 μL的分离效果。

4) 流速的选择。以甲醇-2%冰乙酸(88∶12)为流动相，色谱柱温20℃，进样量30 μL，考察流速分别为1 mL/min和0.8 mL/min的分离效果

5) 流动相比例的选择。在液相色谱柱温20℃，进样量30 μL，流速1 mL/min条件下，考察甲醇-2%冰乙酸流动相比例为90∶10、88∶12、85∶15和50∶50对分离效果的影响。

1.2.3标准溶液的配制

1) 单一标准溶液的配制。分别精确称取0.020 0 g齐墩果酸和0.020 0 g熊果酸标准品用甲醇溶解，转移至25 mL容量瓶中，定容，得到浓度为0.8 μg/μL的齐墩果酸和熊果酸的单一标准溶液。

2) 混合标准储备溶液的制备。取齐墩果酸和熊果酸单一标准溶液各5.00 mL置于10 mL容量瓶中，定容，超声使其充分混合，得齐墩果酸和熊果酸浓度均为0.4 μg/μL的混和标溶液待用。

3) 标准工作溶液的制备。取所配制的混合标准储备溶液，采用逐级稀释法，配制浓度范围为0.025～0.4 μg/μL的齐墩果酸和熊果酸混合标准工作溶液，测定前用0.45 μm微孔滤膜(有机系)过滤，进行检测。

4) 标准曲线的绘制。将所配制的标准工作溶液在最佳色谱条件下，从低浓度至高浓度依次进样分析，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到齐墩果酸、熊果酸线性回归方程。

1.2.4样品前处理精密称取白花蛇舌草样品粉末0.300 0 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入40 mL乙醇，超声提取30 min。冷却至室温后过滤，将滤液用旋转蒸发仪蒸发浓缩近干，再用乙醇定容至2 mL，通过0.45 μm微孔滤膜(有机系)过滤，将滤液置于2 mL进样瓶中待测(置于冰箱中冷藏保存)。照上述步骤制备云南7个不同产地的白花蛇舌草样品溶液待测。

1.2.5系统方法学考察

1) 仪器精密度。将1.2.4配制的第7号(玉溪市元江县咪哩乡)白花蛇舌草样品溶液在最佳色谱条件下连续进样分析3次，计算齐墩果酸和熊果酸峰面积的RSD。

2) 加标回收率。称取10份第7号样品，每份质量为0.300 0 g，分别加入不同量的齐墩果酸和熊果酸，同1.2.4步骤提取制备加标样品溶液，每个加标量(齐墩果酸不同加标量分别为137.60 μg、168.00 μg、199.20 μg，熊果酸不同加标量分别为127.20 μg、148.40 μg、174.90 μg)作3次平行试验。将10组加标样品溶液在最佳色谱条件下逐一进样分析，分别计算样品加标回收率。

1.2.6样品检测将所制备的云南7个不同产地的白花蛇舌草样品溶液在优化的最佳检测条件下依次进样分析。

2结果与分析

2.1检测条件的优化

2.1.1流动相种类试验表明，以乙腈-磷酸钾盐作为缓冲液(pH 8左右)、乙腈-2%冰乙酸作为流动相时，单标、混标及样品溶液都不出峰；但甲醇-2%冰乙酸作流动相对齐墩果酸和熊果酸分离效果相对较好，故选择甲醇-2%冰乙酸作为流动相。

2.1.2柱温柱温也是目标化合物分离效果的一个影响因素。当柱温在25℃、30℃、35℃齐墩果酸和熊果酸分离度均小于1，而当柱温为20℃时，分离度为1.329，此时齐墩果酸和熊果酸的分离效果相对较好，故选择柱温为20℃。

2.1.3进样量进样量的大小影响目标化合物的峰面积和分离度。进样量为20 μL、30 μL和50 μL时，分离度分别为0.814、1.329和0.937，当进样量为30 μL时，齐墩果酸和熊果酸分离度最大，说明分离效果相对较好。故选择30 μL作为进样量。

2.1.4流速流速的快慢不仅影响目标化合物的出峰时间，也影响分离效果。试验表明，流速为0.8 mL/min和1 mL/min时，分离度分别为1.048和1.329，当流速为1 mL/min齐墩果酸和熊果酸的分离度高、出峰快，即对齐墩果酸和熊果酸的分离效果相对较好，故选择流速为1 mL/min。

2.1.5流动相比例当流动相比例为50∶50时，目标化合物没有出峰；流动相比例为90∶10、88∶12时熊果酸和齐墩果酸的分离度小于比例为85∶15时的分离度，在流动相比例为85∶15时，齐墩果酸和熊果酸分离度最大，分离效果相对较好，故甲醇-2%冰乙酸的比例为85∶15。

2.2线性回归方程

齐墩果酸和熊果酸线性回归方程分别为Y=12 756X+86.98(R2=0.999 2)和Y=12 347X+78.029(R2=0.999 4)。说明齐墩果酸和熊果酸在0.025～0.4 μg/μL范围内线性关系良好。单一标准溶液和混合标准溶液在检测条件下，得到色谱图对比图。从图1可以看出，齐墩果酸保留时间比熊果酸短，可以确定齐墩果酸先出峰，熊果酸后出峰，且保留时间分别为16.506 min和17.229 min，混合标准溶液色谱图中得出齐墩果酸和熊果酸分离效果好，可实现同时测定。

注：1，齐墩果酸标准品；2,熊果酸标准品；3和4分别齐墩果酸和熊果酸混标

Note:1,Oleanolic acid standard; 2,Ursolic acid standard; 3 and 4,oleanolic acid and ursolic acid mixed standard

图 1齐墩果酸和熊果酸的HPLC色谱图

Fig.1 HPLC chromatogram of oleanolic acid and ursolic acid

2.3方法学考察

经测定，齐墩果酸和熊果酸峰面积的RSD分别为1.2%和1.01%，均小于2%，表明仪器精密度良好。加标回收率试验表明，齐墩果酸的加标回收率在82.26%～88.01%，平均回收率为85.57%，RSD为2.77%；熊果酸的加标回收率在80.84%～93.08%，平均回收率为84.93%，RSD为4.47%。两者的RSD均小于5%，说明方法准确度良好。

2.4样品含量的测定

从表2可知，云南省7个不同产区白花蛇舌草均含有熊果酸和齐墩果酸，7个不同产区齐墩果酸含量在0.139 7～0.523 8 mg/g，平均值为0.409 6 mg/g，其中，普洱市景谷县景谷镇和红河州个旧市大屯镇产白花蛇舌草中齐墩果酸含量最高，均为0.523 8 mg/g，德宏州芒市江东乡齐墩果酸含量最低，为0.139 7 mg/g。云南不同产区熊果酸含量在0.656 6～2.645 6 mg/g，平均值为1.888 8 mg/g，其中普洱市镇沅县者东镇产白花蛇舌草含量最大，为2.645 6 mg/g，德宏州芒市江东乡齐墩果酸含量最低，为0.6566 mg/g。

表2云南不同产区白花蛇舌草样品中齐墩果酸和熊果酸的含量

Table 2 Contents of oleanolic acid and ursolic acid inH.diffusafrom different habitats in Yunnan mg/g

样品序号Sample No.齐墩果酸含量Oleanolic acid熊果酸含量Ursolic acid10.139 70.656 620.439 32.187 730.523 82.007 340.437 72.645 650.523 82.004 360.492 72.165 870.310 31.554 6

3结论与讨论

试验表明，HPLC法检测7个不同产区白花蛇舌草中均含有齐墩果酸和熊果酸含量的最佳条件为 ZORBAX Eclipse XBD-C18柱(4.6×150 mm, 5 μm)，流动相为甲醇-2%冰乙酸水溶液(85∶15)，柱温为20℃，流速为1 mL/min，检测波长为210 nm，进样量为30 μL。在优化条件下，齐墩果酸和熊果酸混合标准溶液在0.025～0.4 μg/μL范围内线性关系良好，且齐墩果酸加标回收率在82.26%～88.01%，RSD为2.77%；熊果酸加标回收率在80.84%～93.08%，RSD为4.47%。方法的精密度、重复性、稳定性、准确度均良好。采用该法对7个不同产区白花蛇舌草中均含有齐墩果酸和熊果酸，但含量存在差异，7个不同产区齐墩果酸含含量在0.139 7～0.523 8 mg/g，平均值为0.409 6 mg/g；熊果酸含量在0.656 6～2.645 6 mg/g，平均值为1.888 8 mg/g。其中普洱市景谷县景谷镇和红河州个旧市大屯镇产白花蛇舌草中齐墩果酸含量最高，为0.523 8 mg/g。洱市镇沅县者东镇产白花蛇舌草含量最大，为2.645 6 mg/g。

在测定白花蛇舌草中齐墩果酸和熊果酸含量时，流动相的选择将影响齐墩果酸和熊果酸能否出峰，所以流动相的选择至关重要。流动相比例、流速、进样量的优化直接影响到齐墩果酸和熊果酸分离效果及出峰时间。所以在检测过程中要综合考虑到每一个条件，才能保证测定结果的准确可靠。

综上所述，试验所建立的测定白花蛇舌草中齐墩果酸和熊果酸含量的HPLC法，预处理方法简单，测定方法可靠，可运用于白花蛇舌草中齐墩果酸和熊果酸含量的测定和分析。