陈惠花, 朱梅菊△, 朱洪竹, 丁孝民， 王 卉, 毛泽华

(1. 井冈山大学体育学院, 江西 吉安 343009； 2. 井冈山大学后勤保障处, 江西 吉安 343009)

石菖蒲(Acorus tatarinowii Schott)为天南星科菖蒲属植物石菖蒲的干燥根茎, 为延年、益智的要药，《神农本草经》将其列为上品，属于增力类中药之一[1]。研究表明：石菖蒲具有明显的抗运动性疲劳作用[2]。目前大量研究证实，当机体处于疲劳状态时，学习记忆功能受到明显抑制[3-4]。石菖蒲对学习记忆功能的影响报道较多[5]。但石菖蒲对疲劳运动机体学习记忆影响的报道甚少。5-羟甲基糠醛是本课题组从大理产石菖蒲A.tatarinowii中分离得到的化合物[6 ]。近年该化合物的生物活性作用受到高度重视[7]。以往对石菖蒲改善学习记忆的活性成分主要集中在细辛醚部分，对5-羟甲基糠醛研究甚少。为此，本研究拟运用运动疲劳大鼠模型，研究石菖蒲及其活性成分-5-羟甲基糠醛改善疲劳运动大鼠学习记忆和对海马信号分子-细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK) 和cAMP 反应元件结合蛋白(cAMP-responsive element-binding protein, CREB)表达的影响，为寻找新的改善学习记忆活性成分及指导石菖蒲在运动医学领域中的应用提供部分实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组与给药方法

80只、6周龄、清洁级的雄性SD大鼠，体重(201±17)g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司(动物合格证为：SCXK(湘)2011-0003，动物使用证为：SYXK(赣)2017-0003)。分笼饲养，自然光照，动物房内温度(20±3)℃，相对湿度为40%～60%。适应性饲养2 d后, 按完全随机法分为正常组(A)、运动组( B )、运动+5-羟甲基糠醛低、中、高剂量组(C、D、E)、运动+石菖蒲低、中、高剂量治疗组( F、G、 H )，共8组，每组10只。石菖蒲低、中、高剂量组分别按石菖蒲提取物0.12、1.20和4.80 g. kg-1. wt-1，5-羟甲基糠醛低、中、高剂量组分别按5-羟甲基糠醛 0.10、1.00和3.00 mg. kg-1. wt-1，灌胃。每天灌胃1次；正常组、运动组以等体积生理盐水灌胃，药物剂量换算参照文献[8]和预实验结果。每次灌胃时间在运动前2 h。实验时间10 d。

1.2 石菖蒲提取物的制备

石菖蒲1 kg，首先运用二氧化碳超临界萃取法提取石菖蒲挥发油。然后将药物残渣用95%乙醇分别热提3次，减压浓缩成浸膏。再将乙醇提取后的药物残渣用水煎煮3次，在60℃水浴中浓缩成浸膏(每克浸膏含生药10 g)。最后将此三者合并成石菖蒲混合提取物，放4℃冰箱保存备用。石菖蒲提取物中含有α-细辛醚1.35% 和5-羟甲基糠醛 0.015%。

1.3 石菖蒲中5-羟甲基糠醛的分离提取

按文献[6]，具体为：干燥石菖蒲15 kg，粉碎后先用超临界CO2萃取仪提取挥发油。其残渣用95%乙醇热提3次，减压蒸馏得浸膏1 kg。将浸膏溶于蒸馏水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂得乙酸乙酯部分200 g和正丁醇部分250 g。用氯仿-甲醇 ( 9∶1 ～ 1∶1) 对乙酸乙酯部分进行硅胶柱色谱分离，梯度洗脱，分得10个部分( F1～F10)。取其中第9部分-F9( 10 g) 经 Sephadex LH-20 色谱柱分离，氯仿-甲醇( 2∶1) 洗脱，得到5-羟甲基糠醛( 400 mg)。放4℃冰箱保存备用。

1.4 疲劳运动方案

疲劳运动方案按文献[9]。B-H组动物首先进行3 d 适应性跑台训练, 随后开始10 d 的正式跑台运动。负荷分为3级，每级跑速分别为8、15、20 m/min，第1、2级分别运动15 min，第3级运动直至大鼠无法维持跑台预定跑速，滞留于跑道后端3次以上，使用声波和光、电刺激驱赶仍无效，并伴有呼吸急促，腹卧跑台等行为表现。正常组动物相同条件常规饲养, 不参加跑台运动。

1.5 水迷宫实验程序

采用Morris水迷宫(淮北正华)实验测试大鼠空间学习记忆能力。水迷宫测试采用圆形水池(直径120 cm，高60 cm)，水温(22±1)℃，低于水面1 cm 处放置一个全透明的塑料圆形平台(直径10 cm，高50 cm)，迷宫上方安置带有显示系统的摄像机，计算机自动跟踪计时并记录大鼠游泳轨迹。水迷宫实验包括定位航行实验和空间探索实验。

1.5.1 定位航行实验(place navigation test, PNT) 动物购入后，进行PNT训练3 d。PNT训练即：大鼠自由游泳15 min，使大鼠熟悉水池。然后将大鼠随机从东、西、南、北4个入水点面向池壁放入水中，记录大鼠在2 min 内寻找到平台的时间，即逃避潜伏期(escape latency)。如果大鼠在2 min 内未找到平台，采集系统将自动关闭，潜伏期按2 min计算。然后将大鼠引到平台上停留 15 s，2次训练间隔3～5 min。每只大鼠每天接受3次PNT训练，连续3d。第4日进行PNT测验，取3次潜伏期平均值作为逃避潜伏期。水迷宫测验结束后B-H 组大鼠进行10日跑台运动。跑台运动第7、8、9日，所有大鼠均需进行PNT训练。第10日跑台运动结束后，所有大鼠进行PNT测验，重复3次。

1.5.2 空间位置探索实验(spatial probe test, SPT) 用于测量大鼠对平台空间位置的准确记忆，即记忆保持能力。每次PNT测验结束后，撤去平台，从同一入水点面向池壁放入水中，记录大鼠2 min内，穿越原平台位置的次数。

1.6 脑组织的取材

最后一次SPT测试结束后即刻，用25%乌拉坦和0.9%戊巴比妥钠混合液按0.4 ml/kg体重腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉采血后，冰浴中快速剥离双侧海马(称量), 置液氮中速冻，随后转移至-70℃冰箱。保存待测。

1.7 免疫印迹法(Western blot)

在冰浴上用组织匀浆器制备海马脑组织匀浆液，用15 000 g、4℃低温离心15 min，吸取其上清。再重复离心一次。用BCA法进行蛋白浓度测量。样品蛋白用10.0% SDS-PAGE 分离，然后将蛋白转移到PVDF膜上，用封闭液(含5.0 % 脱脂奶粉， 3.0% BSA，0.1%Tween-TBS)进行非特异性封闭常温2 h，洗涤4次，分别加入抗p-ERK1/2(按滴度1∶1 500 稀释)、 抗p-CREB (按滴度1∶2 000 稀释)(美国Sigma公司)，4℃过夜。0.1% Tween-TBS 冲冼5 次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗HRP-IgG (按滴度1∶1000 稀释,北京中山生物技术有限公司) 37℃孵育2 h。0.1% Tween-TBS 冲冼6 次，加入ECL试剂(化学发光剂，美国Primer公司)进行曝光，X 线片记录影像。应用Fluorchem V 2.0 系统进行吸光度测定,以目的条带与内参照GAPDH 的平均吸光度比值表示蛋白水平,进行半定量分析。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠学习记忆功能比较

实验前各组大鼠逃避潜伏期和穿越平台次数,差异无显著性(P均>0.05)。实验后B组大鼠逃避潜伏期显著长于A、D、E、G、H组，穿越平台次数明显少于A、D、E、G、H组，差异具有显著性(P均< 0.01), 但C、F、B组上述指标差异无显著性(P均> 0.05)。5-羟甲基糠醛低、中、高剂量组大鼠逃避潜伏期依次为: C > D >E，而穿越平台次数则相反(P均<0.01)。

石菖蒲提取物低、中和高剂量组上述指标的变化趋势与5-羟甲基糠醛低、中、高剂量组相同。5-羟甲基糠醛低、中、高剂量组大鼠逃避潜伏期分别与石菖蒲提取物低、中和高剂量比较，有延长的趋势，而穿越平台次数则有减少趋势，但差异均无显著性，(P均>0.05，表1)。

Tab. 1 Comparison of learning and memory functions among groups before and after n= 10)

A: Control group； B: Exercise group； C: Exercise+5-hydroxymethyl furfural-L； D: Exercise+5-hydroxymethyl furfural-M, E: Exercise+5-hydroxymethyl furfural-H； F: Exercise+AcorustatarinowiiSchott-L； G: Exercise+AcorustatarinowiiSchott-M； H: Exercise+AcorustatarinowiiSchott-H

**P<0.01vscontrol group (A);##P<0.01vsexercise group (B);△△P<0.01vsexercise+5-hydroxymethyl furfural-M (D);▲▲P<0.01vsexercise+5-hydroxymethyl furfural-H(E);○○P<0.01 exercise+AcorustatarinowiiSchott-M (G) ；●●P<0.01vsexercise+AcorustatarinowiiSchott-H (H)

2.2 各组大鼠海马信号分子P-ERK1/2蛋白表达水平比较

各组大鼠海马p-ERK1/2蛋白表达水平比较见图1 。由图1 可知B组大鼠海马p-ERK1蛋白表达水平显著低于A、D、E、G、H组(P<0.01或P< 0.05), 但与C、F组比较，差异无显著性(P均> 0.05)。5-羟甲基糠醛低、中、高剂量组大鼠海马p-ERK1蛋白表达水平依次为: C < D < E, 均P< 0.01。石菖蒲提取物低、中和高剂量组大鼠海马p-ERK1蛋白表达水平的变化趋势与5-羟甲基糠醛低、中、高剂量组相同。5-羟甲基糠醛中剂量组大鼠海马p-ERK1蛋白表达水平低于石菖蒲提取中剂量组(P<0.05), 但5-羟甲基糠醛低、高剂量组大鼠海马p-ERK1蛋白表达水平分别与石菖蒲提取物低和高剂量组比较,差异无显著性,均P>0.05。海马P-ERK2蛋白表达水平除E组低于A和H组,P< 0.05外, 其变化趋势与P-ERK1相同。

Fig.1Comparison of the levels ofp-ERK1/2 protein expression in hippocampus among groups

A: Control group； B: Exercise group; C: Exercise+5-hydroxymethyl furfural-L; D: Exercise+5-hydroxymethyl furfural-M; E: Exercise+5-hydroxymethyl furfural-H; F: Exercise+AcorustatarinowiiSchott-L; G: Exercise+AcorustatarinowiiSchott-M; H: Exercise+AcorustatarinowiiSchott-H

**P<0.01vscontrol group (A);#P<0.05,##P<0.01vsexercise group (B);△△P<0.01vsexercise+5-hydroxymethyl furfural-M (D);▲▲P<0.01vsexercise+5-hydroxymethyl furfural-H(E);○P<0.05,○○P<0.01 exercise+AcorustatarinowiiSchott-M (G);●●P<0.01vsexercise+AcorustatarinowiiSchott-H (H)

2.3 各组大鼠海马信号分子P-CREB蛋白表达比较

各组大鼠海马信号分子p-CREB蛋白表达水平比较见图2。由图2可知B组大鼠海马P-CREB蛋白表达水平显著低于A、D、E、G、H组(P<0.01或P<0.05), 但与C、F组比较，差异无显著性(P均> 0.05)。5-羟甲基糠醛低、中、高剂量组大鼠海马P-CREB蛋白表达水平依次为: C < D < E(P均< 0.01)。石菖蒲提取物低、中和高剂量组大鼠海马P-CREB蛋白表达水平的变化趋势与5-羟甲基糠醛低、中、高剂量组相同。5-羟甲基糠醛中剂量组大鼠海马P-CREB蛋白表达水平低于石菖蒲提取中剂量组(P<0.01), 但5-羟甲基糠醛低、高剂量组大鼠海马P-CREB蛋白表达水平分别与石菖蒲提取物低、高剂量组比较,差异无显著性(P均>0.05)。

Fig.2Comparison of the levels ofp-CREB protein expression in hippocampus among groups

A: Control group; B: Exercise group; C: Exercise+5-hydroxymethyl furfural-L; D: Exercise+5-hydroxymethyl furfural-M; E: Exercise+5-hydroxymethyl furfural-H; F: Exercise+AcorustatarinowiiSchott-L; G: Exercise+AcorustatarinowiiSchott-M; H: Exercise+AcorustatarinowiiSchott-H

**P<0.01vscontrol group (A);#P<0.05,##P<0.01vsexercise group (B);△△P<0.01vsexercise+5-hydroxymethyl furfural-M (D);▲▲P<0.01vsexercise+5-hydroxymethyl furfural-H(E);○P<0.05,○○P<0.01 exercise+AcorustatarinowiiSchott-M (G) ;●●P<0.01vsexercise+AcorustatarinowiiSchott-H (H)

3 讨论

当机体处于疲劳状态时，学习记忆功能受到明显抑制。因此寻找有效的药物改善疲劳机体的学习记忆功能，意义重大。目前改善疲劳运动机体学习记忆下降的药物研究主要有儿茶素没食子酸酯( epigallocatechin gallate, EGCG)和螺旋藻[10-11 ]等。中药石菖蒲(acorustatarinowiiSchott)为天南星科菖蒲属植物石菖蒲的干燥根茎。改善机体学习记忆是石菖蒲的主要药理作用之一[12]，但有关石菖蒲改善疲劳运动机体学习记忆方面的报道甚少。本研究结果表明石菖蒲能明显改善疲劳机体学习记忆功能，并随其剂量的增加,其作用增强。

有关石菖蒲改善机体学习记忆的活性成分主要集中在石菖蒲挥发油中的β-细辛醚[13-14]。而近年研究表明石菖蒲水煎液同样具有较好的改善机体学习记忆作用[15]。提示石菖蒲改善机体学习记忆的活性成分可能不仅仅是挥发油中的细辛醚部分，对此值得深入研究。5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethyl furfural, 5-HMF)是本室从石菖蒲的水煎液中分离提取的产物[6]。本研究结果表明从石菖蒲水煎液中分离得到的5-羟甲基糠醛亦能较明显地改善疲劳运动机体学习记忆功能。

近年来,神经系统中信号转导通路的变化与学习记忆关系的研究成为新热点[16-17]。ERK 广泛分布于中枢神经系统，在海马和前额叶皮质的表达尤其显著，其磷酸化形式能够介导胞外信息向胞核内转移，在调节神经元的增殖、分化和提高学习记忆等方面起重要作用[18-19]。ERK信号通路与学习记忆密切相关[20]。ERK信号途径可能是多种海马突触可塑性诱导的共同机制[21-22]。CREB 是 ERK 最重要的下游信号分子之一，ERK 信号通路在调节 CREB 磷酸化方面起关键作用，可通过磷酸化其下游信号分子CREB 而调节CREB、ELK的活性, 进而激活记忆相关基因表达, 参与记忆和长时程增强(long-term potentiation，LTP)的调控[23]。有研究表明适宜运动能使中枢神经系统ERK与CREB 的磷酸化水平持续升高，从而有益于学习记忆[24]。本研究结果表明：疲劳运动后大鼠海马脑组织P-ERK1/2和p-CREB蛋白表达水平明显下降，提示ERK-CREB 信号通路下调可能参与疲劳运动致学习记忆受损的机制。

研究表明石菖蒲-远志药对能促进AD模型大鼠海马内突触蛋白的表达，尤以水提物组分效果明显[25]。石菖蒲能通过保护神经元和增强海马突触可塑性，改善痴呆大鼠学习记忆功能[26]。本研究表明：石菖蒲能明显提高疲劳运动大鼠海马脑组织P-ERK1/2和p-CREB蛋白表达水平。而ERK信号途径又可能是多种海马突触可塑性诱导的共同机制[21-22]。提示上调海马ERK信号可能是石菖蒲改善机体学习记忆的重要作用机制之一。研究表明5-羟甲基糠醛能改善脑缺血/再灌注模型小鼠学习记忆功能，其机理与纠正自由基代谢失衡有关[27]。从地黄中分离得到的5-羟甲基糠醛，能明显上调海马神经元中与学习记忆相关的信号分子，包括：p-ERK，p-CREB和BDNF 等[28]。本研究表明从石菖蒲水煎液中分离得到的5-羟甲基糠醛能明显改善疲劳运动大鼠的学习记忆，并能提高疲劳运动大鼠海马脑组织P-ERK1/2和p-CREB蛋白表达水平，提示5-羟甲基糠醛可能是石菖蒲水提物改善学习记忆的主要活性成分之一，其作用机理与5-羟甲基糠醛上调海马ERK/CREB信号有关。但石菖蒲及其活性成分-5-羟甲基糠醛对海马ERK/CREB信号转导通路作用强度的大小，还需进一步应用激活剂或抑制剂进行观察。

综上,本研究结果表明石菖蒲及其活性成分-5-羟甲基糠醛能明显改善疲劳运动大鼠学习记忆，其机理与其提高海马p-ERK1/2和p-CREB蛋白表达水平有关。5-羟甲基糠醛可能是石菖蒲改善机体学习记忆的活性成分之一。为石菖蒲在运动医学中的运用及新的益智类药物研发提供了新的思路。