韩远芳，赵帅琪，李伊然，谷 思，邢 宇

(北京农学院 植物科学技术学院，农业应用新技术北京市重点实验室，北京林果业生态功能提升协同创新中心，北京 102206)

存在于高等植物中的WRKY 转录因子是植物中最大的转录因子家族之一，因其氨基酸序列中含有高度保守的WRKY结构域而得名。WRKY蛋白根据序列中WRKY域的数量以及锌指结构的类型，将WRKY转录因子分为三组(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)。WRKY蛋白另一个典型的特征是通过与其靶基因启动子中的W-box [TGACC(A / T)]结合来调控下游基因的表达[1]。

植物生长在外界坏境中会受到各种各样的侵害，当植物机体受到机械损伤、病原物侵害、生物胁迫以及非生物胁迫时，WRKY基因都可以快速而大量的表达[2]。目前，越来越多的WRKY基因都被证明与植物抗病有关，例如，OsWRKY22不仅能够正向调控稻瘟病，还能与ART1互作共同调控增强水稻的耐铝性[3]；将辣椒中的CaWRKY27在烟草中过表达后发现增强了其对青枯病的抗性[4]。

草莓(Fragaria×ananassa)蔷薇科草莓属的多年生草本植物[5]，因其香甜可口颜色艳丽又富含多种营养物质，而深受人们喜爱，到目前为止，我国草莓的种植面积和产量都处于世界领先地位，但是在草莓生产中，长年连续栽种使草莓重茬病害频发，导致产量下降品质降低。

草莓的倍性丰富，栽培草莓多以八倍体为主供人们食用，而二倍体草莓多为野生草莓，具有遗传背景简单，基因组小，生命周期短等特点，进而成为研究草莓基因功能的理想模式植物。本文以森林草莓‘Hawaii 4’作为试验材料，通过基因克隆、生物信息学分析及实时荧光定量分析等手段，以期阐明FvWRKY22在草莓抗重茬中的作用，对草莓抗重茬病的改良具有十分重要意义。

1 材料和方法

1.1 试验材料与处理

主要以培养在人工气候室的二倍体森林草莓‘Hawaii 4’(Fragariavesca, ‘Hawaii 4’)以及‘Hawaii 4’组培苗为材料。

黄亚丽等[6]选取8个草莓连作区选取的草莓病株中分离出3种主要致病菌: 尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)和大丽轮枝菌(Verticilliumdahlia)。选取保存在PDA斜面培养基上的尖孢镰刀菌(由北京农学院生物科学与工程学院张国庆老师提供)和立枯丝核菌(由北京农学院植物科学技术学院赵晓燕老师提供)进行活化，25 ℃培养，形成新鲜的菌丝后，接种于P20培养基中，培养三天后将草莓幼苗接种于接过菌的培养基中，使菌丝与草莓根部接触，在侵染后的0、1、3、6、12、24 h、3 d、5 d、7 d分别采集草莓根部组织，液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱。

1.2 试验方法

1.2.1FvWRKY22的克隆 森林草莓‘Hawaii 4’组织的总RNA由购于美国OMEGA公司的Plant RNA Kit提取，方法详见试剂盒说明书，经过DNA纯化后，以Prime ScriptTMDouble Strand cDNA Synthesis Kit (Takara)进行反转录合成cDNA，-20 ℃保存备用。

以拟南芥AtWRKY22蛋白保守序列为电子探针，在草莓基因组数据库进行比对，找到1个同源性很高的基因，命名为FvWRKY22。根据该基因的CDS序列，使用Primer软件设计引物，正向引物序列为：5’-ATGGAAGACGATTGGGATCTC-3’, 反向引物序列为：5’-TCAGATACTACTGGCGGC-3’，并由生工生物工程(上海)有限公司合成。以森林草莓cDNA为模板进行PCR。

检测后采用Axygen公司的胶回收试剂盒回收目的片段，方法详见说明书，将回收产物与pGEM®-T Easy (Promega)载体进行连接，然后转化进大肠杆菌DH5α中，涂板后置于37 ℃恒温培养箱中过夜培养，进行蓝白斑筛选。菌落PCR验证呈阳性后送于北京六合华大科技有限公司进行测序。

1.2.2FvWRKY22生物信息学分析 利用ExPaSy对FvWRKY22基因编码的蛋白质理化性质进行分析及蛋白质的亲/疏水性分析；利用GOR4进行蛋白二级结构分析；利用NLS mapper进行核定位信号分析；利用DNAMAN、ClustalX进行序列比对；利用MEGA X构建进化树。

1.2.3 实时荧光定量PCR 用于qRT-PCR的引物使用Beacon Designer 7.9软件进行设计，正向引物序列为5’-CTTCTCTGTTCTTCCTATTGTT-3’,反向引物序列为5’-TTGTGGAGTTGTTGATGG-3’, 引物经过检测符合要求后用于试验，内参基因为FvActin。采用SYBR®Premix TaqTMMix试剂盒，反应体系为cDNA模板2 μL，前后引物各0.25 μL，SYBR Green Ⅱ 5μL，加入ddH2O补至10 μL，反应程序为： 95 ℃ 10 min；95 ℃ 20 s，54 ℃ 20s，72 ℃ 20 s，39个循环。设3次平行重复，利用Light Cycler®96 SW1.1 Real-Time PCR System进行分析。

2 结果与分析

2.1 FvWRKY22基因的克隆

以森林草莓各组织cDNA为模板对森林草莓FvWRKY22基因的全长进行克隆。PCR产物电泳检测如图1所示，将大小正确的目的条带进行胶回收、连接、转化、涂板、菌落PCR和测序之后，用 DNAMAN 5.2.2软件进行序列拼接和比对，比对结果发现测序结果与基因组序列信息完全吻合，确认成功克隆到FvWRKY22，将得到的菌液进行保菌于-80 ℃冰箱中保存，提取的质粒于-20 ℃保存。

2.2 FvWRKY22基因的序列分析

通过DNAMAN软件对FvWRKY22进行分析，FvWRKY22开放阅读框为1038bp，编码345个氨基酸，在位于第169～225氨基酸之间含有一个典型的WRKY结构域，属于WRKY转录因子家族Ⅱ类e亚族，其锌指结构为C-X5-C-X23-H-X-H。利用生物信息学网站解析FvWRKY22蛋白的理化性质，其结果表明，FvWRKY22基因编码的蛋白质分子量为37.72 kD，理论等电点为8.5，为疏水蛋白，蛋白质二级结构分析表明，α螺旋和β螺旋所占比例分别为16.81 %和18.26 %，无规则卷曲作为该蛋白二级结构的主要组成元件所占的比例较高，为64.93 %，利用NLS mapper分析该基因核定位信号序列为QRSKKRKNL (图2)。

M: DL2000; 1-4均为FvWRKY22扩增产物图1 FvWRKY22基因扩增M: DL2000; 1-4 are FvWRKY22 PCR productsFig.1 The PCR product in FvWRKY22 genes

通过blast比对，选取Ident数较高的序列(RcWRKY22: >PRQ58289.1;PpWRKY22: >XP_007218198.1;PaWRKY22: >XP_021807936.1;PpWRKY14: >AOT85447.1;MdWRKY22-like: >XP_008347124.1;ZjWRKY68: >AYD59726.1;TcWRKY22: >XP_007051705.2;CcWRKY22: >XP_006444950.1;HbWRKY22-like: >XP_021644094.1;ZjWRKY59: >AYD59718.1;AtWRKY22: >NP_192034.1)，利用Mega X软件比较FvWRKY22与上述基因进化关系，结果如图3发现在进化上与FvWRKY22关系最近的是月季RcWRKY22(登录号: >PRQ58289.1)。运用ClustalX软件对森林草莓FvWRKY22的氨基酸序列与上述基因的氨基酸的进行同源性比较，结果如图4发现所比较的所有基因的氨基酸序列都集中在1个WRKY保守域中。

黄色高亮处为WRKY域，红框处为锌指结构，黑线处为核定位信号图2 森林草莓FvWRKY22的CDS区及其编码的氨基酸 The yellow-highlight part represents WRKY domain. The red box represents a Zinc finger,andthe underlined part is a nuclear location signal Fig.2 The CDS sequence and amino acid of FvWRKY22

图3 根据氨基酸序列聚类的植物WRKY22基因进化关系分析Fig.3 Phylogenetic relationship based on amino acid sequence among plant WRKY22

2.3 FvWRKY22基因的表达分析

将FvWRKY22在森林草莓‘Hawaii 4’的不同组织部位进行基因表达量分析，如图5，FvWRKY22在根、茎、叶中均有表达，在果实中表达量相对较低，几乎没有表达。由图6可以看出，在经过立枯丝核菌和尖孢镰刀菌诱导后，FvWRKY22的表达量均呈现相同的趋势，即先增加后降低再增加再降低，在处理后1 h表达量达到最大，分别是处理前的2.16倍和5.22倍，因此，推测FvWRKY22基因可能参与了草莓重茬病的免疫反应。

黑线处为WRKY保守域，方框所标出的序列为核定位信号图4 不同植物中WRKY22同源基因的序列比对The thick underline indicates the domain of WRKY, box indicates nuclear localization signal sequenceFig.4 Alignment of plant WRKY22 gene homologous sequences based on amino acid sequence clustering

图5 FvWRKY22基因的表达分析Fig.5 Expression Analysis of FvWRKY22

图6 FvWRKY22基因在重茬病菌侵染后的相对表达量Fig.6 The relative expression of FvWRKY22 gene after the treatment of replant disease

3 讨 论

WRKY家族是高等植物中特有的转录因子，对植物生长发育的各个阶段都有重要的调控作用。本研究以森林草莓‘Hawaii 4’为研究材料，基因利用qRT-PCR技术分析经过重茬病菌立枯丝核菌和尖孢镰刀菌的诱导后FvWRKY22的表达模式。有研究表明，OsWRKY6在白叶枯病菌侵染水稻幼苗后表达量持续增加[7]；GhWRKY15经过枯萎病菌诱导后表达量呈现先增加后降低趋势[8]，结合本研究，森林草莓在经过重茬病菌侵染之后，FvWRKY22的表达呈现先增加后降低再增加再降低的表达趋势，且在侵染1 h后表达量最高，与上述研究结果有一定差异，一方面可能与取样时间存在差异有关。另一方面可能是当病原菌侵染植物时，不同植物做出的反应机制不同，许多植物表现出抗病和感病的差别主要是由病原菌侵染植物时抗性反应的时序性导致的，病原菌侵染植物后抗、感株系均会有防御反应发生，只是抗病株系的防御反应速度较快且强烈，而感病植株对病菌的防御反应比较迟缓且信号较弱，以至于防御反应对病原菌的侵染没有抵抗作用[9]。因此推测，当立枯丝核菌侵染森林草莓植株时，FvWRKY22的表达量在1 h达到最高，说明植株对于病菌产生防御反应，但当病原菌持续侵染时，植株感病，表达量降低，随着侵染时间的增加，感病植株再次产生防御反应，表达量再次增加，但对病菌没有抵抗作用，植株死亡。另一种病原菌尖孢镰刀菌对森林草莓侵染后，FvWRKY22也表现出相似的表达趋势。通过对FvWRKY22的克隆及表达分析，推测转录因子FvWRKY22可能与草莓重茬病的抗性有关，为提升草莓品质和品种改良提供了理论支持。