25羟基维生素D浓度及其受体基因多态性与儿童哮喘的相关性研究

2019-11-01朱莉李建华马晓波

实验与检验医学 2019年5期

朱莉，李建华，马晓波

(平顶山市第二人民医院儿科，河南平顶山，467000)

儿童哮喘的发生严重影响了患儿的日常生活质量。流行病学研究显示，儿童哮喘的发病率可达334～555／10万人左右[1]，临床上合并有自身免疫性疾病的人群中，哮喘的发生率可进一步上升[2]。不同的因素均可能影响局部呼吸道平滑肌的痉挛，导致哮喘的发生，特别是细胞因子等的改变，能够通过加剧局部呼吸道黏膜上皮细胞的代谢、平滑肌的收缩、局部免疫平衡的紊乱等，从而促进儿童哮喘的发生。25羟基维生素D能够通过影响局部炎症反应、抑制自身免疫性损伤，稳定T淋巴细胞免疫等，进而参与到哮喘的发生过程中[3，4]。部分研究已经探讨并分析了25羟基维生素D在促进哮喘发生过程中的作用，认为25羟基维生素D的表达下降会增加哮喘易感性，导致哮喘治疗不佳的重要因素[5，6]，但对于不同25羟基维生素SNP位点多态性的分析研究少见。为了进一步揭示25羟基维生素D多态性在影响儿童哮喘发生过程中的作用，本次研究选取2016年1月至2017年12月在我院治疗的哮喘患儿97例，探讨了相关指标的表达及其与患者病情的关系，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2016年1月至2017年12月在我院治疗的哮喘患儿97例(观察组)，其中轻度哮喘25例，中度哮喘40例，重度哮喘32。纳入标准：(1)符合中华医学会儿科学会呼吸学组制定的儿童哮喘诊断标准；(2)年龄≤12岁；(3)患儿监护人知情同意。排除标准：(1)入院前1周有激素药物治疗史；(2)合并有代谢性疾病、结核、血液系统疾病、急慢性感染等疾病。同时选取100例健康儿童作为对照组，观察组和对照组一般资料比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表 1。

表1 两组一般资料比较

1.2 检测方法多态性检测：取冻存的血清保存液体，按照10000r／min的离心速度进行离心分离，每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，进行裂解操作，4°C冰上采用无酶的RNA冲洗液进行洗涤，再次10000r／min离心5min，得到RNA。混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3min，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60min，室温放置5min使其完全溶解，使其逆转录为cDNA。以βactin为模版，在反应体系中加入SYBR Green 1染料、上游引物、下游引物、dNTP，使得总体积达20ul，上机，反应条件为：93℃2min、93℃ 1min、55℃2min，共40个循环。PCR产物扩增后进行基因多态性检测：参考multiplexkit试剂盒(南京凯基生物科技有限公司)使用说明，加入各位点对应延伸引物进行单碱基测序反应。并在ABI1310(Life Technologies，美国)进行电泳，结果用 GENEMAPPER软件(Life Technologies，美国)进行分析。清晨采集空腹静脉血，1000r／min 离心 10min，-20℃保存待测，采集标本后1周内检测25-(OH)-VD水平。采用电化学发光全自动免疫分析仪(美国雅培i2000)及试剂盒，检测试剂盒购自福建新大陆生物技术有限公司。

1.3 统计学处理统计分析采用SPSS19.0软件，计量资料采用()表示，两组间比较使用t检验，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验；计数资料比较使用x2检验；相关性采用Pearson相关分析。基因型频率遗传平衡采用Hardy-Weinberg平衡检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 观察组和对照组25-(OH)-VD水平观察组25-(OH)-VD明显低于对照组，差异比较有统计学意义(P＜0.05)，见表 2。

表2 观察组和对照组25－(OH)－VD水平

2.2 观察组不同病情患儿25-(OH)-VD和肺功能比较重度患儿25-(OH)-VD、FEV1和FVC明显低于中度和轻度患儿(P＜0.05)；中度患儿25-(OH)-VD、FEV1和FVC明显低于轻度患儿(P＜0.05)。见表3。

2.3 相关性分析将哮喘患儿25-(OH)-VD与肺功能进行相关分析，结果显示25-(OH)-VD与FEV1、FVC 呈正相关(r=0.403 和 0.322，P＜0.05)。

2.4 观察组和对照组VDR基因SNP位点基因型和等位基因分布观察组和对照组SNP位点rs2228570、rs1544410和 rs2282679符合 Hardy-Weinberg平衡检验；观察组和对照组SNP位点rs2228570和rs2282679基因型和等位基因分布差异无统计学意义(P＞0.05)；观察组和对照组SNP位点1544410基因型和等位基因分布为10.31%比较差异有统计学意义(P＜0.05)，见表4、表5和表6。

3 讨论

儿童哮喘的发生可以导致心血管不良临床结局的产生，从而加剧患者远期生存的恶化，增加病死率及致残率。近年来虽然在儿童哮喘的治疗或者康复等方面取得了一定的效果，但其治疗总体有效率或者病情缓解率等指标均无明显改善[7]。本次探讨了25羟基维生素D浓度及其受体基因多态性及其与哮喘患者病情的关系，具有下列几个方面的现实意义：(1)能够为哮喘的生物学治疗提供理论基础，为改善哮喘的急性期哮喘症状、改善肺通气或者肺换气等提供理论基础；(2)能够为哮喘治疗后的临床预后评估提供新的指标。

25羟基维生素D在结合糖蛋白配体后，可以促进细胞核内的三磷酸腺苷信号通路的激活，抑制细胞炎症因子如IL-6或者肿瘤坏死因子的激活等，减轻炎症因子对于支气管平滑肌的浸润，保护平滑肌细胞膜的完整性[8]；25羟基维生素D包含了多个可结合巯基的末端羧基结构，其与平滑肌细胞膜上钙离子内流通道的结合，能够降低钙离子内流，促进血管内皮细胞分泌一氧化氮，促进平滑肌的扩张[9，10]。25羟基维生素D多态性的改变，能够影响25羟基维生素D的生物学活性并抑制谷胱甘肽芳基转移酶的活性，减轻氧化应激性损伤和线粒体或者氧化自由基对于平滑肌、黏膜组织的浸润作用[11，12]。已经证实的是，25羟基维生素D浓度对于儿童哮喘的发生、治疗结局、临床预后等均具有一定的影响，但对于SNP位点rs2228570和rs2282679等基因型或者等位基因的研究不足。

本次研究通过相关指标的血清学水平的检测分析发现，25-(OH)-VD在哮喘儿童中的表达浓度可显著下降，从机制上考虑25-(OH)-VD的表达对于儿童哮喘的影响主要考虑与下列几个方面有关[13，14]：(1)25-(OH)-VD的低表达会促进肺泡上皮细胞小气道的狭窄，过度下降的25-(OH)-VD失去了其对于钙离子通道的稳定作用，导致平滑肌的持续性处于氧化应激状态；(2)25-(OH)-VD的低表达失去了其对于患者局部T淋巴细胞免疫功能的调控作用，导致病毒感染等诱导的平滑肌痉挛更为显著。赵宏霞等[15]研究者在探讨分析了73例哮喘儿童的血清学资料，发现25-(OH)-VD的表达浓度可平均下降25%以上，同时患儿的病情严重程度越高、治疗后的病情缓解率越低，25-(OH)-VD的表达下降越为显著。在不同的哮喘病情中可以发现哮喘的严重程度越高，25-(OH)-VD的表达下降越为明显，提示了25-(OH)-VD与哮喘病情严重程度间的关系，这主要由于25-(OH)-VD对于哮喘病情进展过程中平滑肌细胞的收缩状态的调控作用有关。但也有研究认为25-(OH)-VD的表达只与哮喘的发生有关，而与哮喘的病情无显著性关系，存在相关结论差别的原因主要考虑与临床病例的发病病程、基础性治疗措施等的差别有关。在探讨25-(OH)-VD与肺功能的关系过程中发现可见，25-(OH)-VD与FEV1、FVC呈正相关，这主要由于25-(OH)-VD通过改善肺通气或者肺换气过程而影响到第一秒呼气末期容积。最后，本文在探讨25羟基维生素D的基因多态性的过程中发现，SNP位点1544410基因型和等位基因分布存在显著的差别，其中GA或者A等位基因的比例明显上升，提示GA或者A等位基因的差别可能是影响到25羟基维生素D多态性的主要位点。