康晓军，李燕

(巩义市人民医院检验科，河南 巩义451200)

大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一种具有多项分化潜能的间充质干细胞[1]，在再生医学领域具有较大的应用前景[2-5]。研究表明，BMSCs可能有助于脊髓修复[6]，同时在治疗多种罕见病中可能具有一定意义。例如，研究证实BMSCs能够改善心肌缺血损伤后修复，这可能通过分泌调节因子产生效应[7,8]，通过某些化合物，比如透明质酸作用后，这种保护效应可能更明显[9]。近年来越来越多的研究聚焦在中药以及中药中天然单体化合物在BMSCs中的调控效应上。淫羊藿素作用于BMSCs后，细胞增殖加快，这为细胞的扩增与大量获取提供了新颖的途径[10]，这可能与EGF产生相似的效应[11]。在定向分化方面，也有研究者证实中药具有积极效应[12,13]。

染料木素是来源于大豆中的天然黄酮化合物，在先前的研究中，具有包括抗炎，抗氧化，抗肿瘤和调节血脂等生物学活性[14,15]。但是没有研究报道其在干细胞增殖过程中具有调节作用。本实验只在探索染料木素对大鼠骨髓间充质干细胞增值能力的影响并初步证实其作用机制，为染料木素进一步应用提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料 实验动物：SD大鼠2只，鼠龄3～4周，

购于重庆第三军医大学大坪医院实验动物中心(动物许可证号 SCXK(渝)2012-0005)。 主要试剂：FBS、DMEM低糖型培养基购于Hyclone公司。兔抗大鼠CD29-FITC(MA182001)、CD 45-FITC(MA182348)、CD 90-FITC(MA182247)抗体购于美国BD公司。成骨(RASMX-90021)、成脂(MKCMA-90031)诱导分化培养基试剂盒购于赛业(广州)生物科技有限公司。CCK-8试剂盒购于日本同仁公司(RK-067)。兔抗人 β-actin(QC-074)、Bcl-2(QC-134)和 Bax(QC-027)一抗和偶联辣根过氧化物酶羊抗兔二抗(QC-1679)购于美国CST公司。染料木素(ST-215439)购于美国西格玛公司。所有的引物由上海生工合成。凋亡检测试剂盒(S0185)购自碧云天试剂公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的提取与培养 颈椎脱臼法处死大鼠后于无菌条件下分离四肢长骨并去除残留组织。用注射器吸取DMEM低糖型培养基反复冲洗骨髓腔，随后离心搜集细胞。重悬后接种于培养瓶中，置于37℃、5%的CO2以及饱和湿度的细胞培养箱内培养，每3d换液一次，当贴壁细胞融合度为80%～90%时传代培养。使用第3代(P3)细胞进行试验。

1.2.2 流式细胞术鉴定BMSCs表型 P3大鼠骨髓间充质干细胞融合度为90%时，消化重悬细胞，洗涤后分别加入 CD 29-FITC、CD45-FITC、CD90-FITC抗体各 2 μL，37℃避光孵育 30 min， 预冷的PBS洗涤2遍，用0.5 mL浓度为1%的多聚甲醛重悬固定30 min，流式细胞仪(美国，贝克曼，FC500)检测荧光强度。

1.2.3 成骨成脂分化鉴定 P3大鼠骨髓间充质干细胞按照每孔2×105个细胞接种至6孔板中，培养融合度至60%～70%，加入成骨诱导分化完全培养基2ml。随后按照试剂盒说明书进行诱导分化。成脂诱导分化时6孔板中要求细胞融合度为100%或者过融合，按照试剂盒说明书进行诱导和染色，于显微镜下观察并拍照。

1.2.4 通过CCK-8法检测细胞增殖 P3大鼠骨髓间充质干细胞按照每孔2×103个细胞接种至96孔板中，适应培养过夜后，使用20μg/ml的染料木素处理细胞，连续培养7d，每天同一时间加入培养基10%体积的CCK-8试剂，孵育2h后在酶标仪450nm波长处检测吸光度值。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 P3大鼠骨髓间充质干细胞以每孔1×106个细胞密度接种于6孔板中，贴壁生长24h后，使用20 μg/ml的染料木素处理细胞48h，同时搜集上清中的细胞和贴壁细胞重悬后，按照AV/PI凋亡检测试剂盒说明书孵育抗体，使用流式细胞仪进行凋亡检测。

1.2.6 实时荧光定量PCR P3大鼠骨髓间充质干细胞消化重悬后以5×105个/孔的密度接种于6孔板中，适应生长过夜后，加入终浓度为20 μg/ml的染料木素处理细胞48h，以未加染料木素的细胞作为阴性对照，按照total RNA提取试剂盒说明书操作，提取细胞total RNA。吸光度法检测RNA浓度，按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录，构建cDNA。加入相应试剂和荧光染料SYRB后，执行荧光定量PCR仪器进行检测，实验程序为：95℃预变性 15 s；95℃变性 5 s；65℃退火 30 s；40 个循环。最后结果以2-△△ct进行计算。实验重复三次。引物序列如下所示：

1.2.7 蛋白印记法检测相关蛋白表达水平 P3大鼠骨髓间充质干细胞消化重悬后以5×105个/孔的密度接种于6孔板中，适应生长过夜后，加入终浓度为20 μg/ml的染料木素处理细胞48h，以未加染料木素的细胞作为阴性对照，加入相应体积的R细胞裂解液提取细胞总蛋白。通过BCA法检测蛋白浓度并变形蛋白。配制SDS-PAGE凝胶后，对变性蛋白溶液进行凝胶分离，转移进入PVDF膜上，使用5%的BSA常温封闭2 h，切膜后分别加入已经稀释完毕的兔抗人β-actin、Bcl-2和Bax一抗，4℃孵育过夜。TBST清洗后加入已经稀释完毕的HRP偶联羊抗兔二抗，室温孵育2 h。清洗后使用专用的ECL进行曝光。最终结果以β-actin作为内参，统计各组蛋白的相对表达量。

1.2.8 统计方法 所有的结果均以均数±标准差表示，使用SPSS 21.0进行统计分析。两组间差异比较使用t检验进行统计。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠BMSCs的鉴定 提取原代细胞后，经过为期两周的纯化和培养，BMSCs逐渐成簇生长，见图1A。通过成骨成脂诱导分化培养基的定向诱导后，提取的细胞具有多项分化的能力，见图1B、1C。流式细胞仪鉴定提取细胞表型，CD45阴性表达，CD29和CD90阳性表达，见图1D。上述结果表明提取的细胞为大鼠骨髓间充质干细胞。

图1 大鼠骨髓间充质干细胞的鉴定

2.2 染料木素对BMSCs增殖能力的影响 细胞培养至P3后，以一定密度接种至96孔板中，使用不同浓度的染料木素处理细胞后，观察BMSCs生长情况。结果表明染料木素显著抑制BMSCs生长的其实浓度为20 μg/ml(P＜0.05)。在上述实验基础上，选取20 μg/ml的染料木素作为后续作用浓度，检测其增殖曲线。结果表明染料木素显著抑制BMSCs的生长，P＜0.05。 见图 2。

图2 染料木素抑制BMSCs的增殖，*P＜0.05，差异具有统计学意义。

2.3 染料木素对BMSCs凋亡的影响 细胞培养至P3后，以一定密度接种至6孔板中，使用染料木素处理细胞后，通过流式细胞术检测细胞凋亡率。结果表明染料木素诱导细胞发生凋亡,P＜0.05。见图3。2.4染料木素对BMSCs凋亡相关基因表达的影响细胞培养至P3后，以一定密度接种至6孔板中，使用染料木素处理细胞后，提取细胞总蛋白和总RNA并检测凋亡相关基因的表达水平。结果表明，不论是在转录水平还是翻译水平，染料木素都显著上调BMSCs细胞Bax的表达水平，同时下调Bcl-2的表达水平，P＜0.05。 见图4。

图3 染料木素诱导BMSCs发生凋亡，*P＜0.05，差异具有统计学意义。

图4 染料木素调节凋亡相关基因的表达，*P＜0.05，差异具有统计学意义。

3 结论

近年来，干细胞在多种疾病中的有益作用逐渐被发现[16]。随着提取技术不断完善[17,18]以及低免疫原等特性的发现，间充质干细胞在再生医学中受到重视。骨髓间充质干细胞是一种来源于骨髓的间充质干细胞，增殖能力较强，免疫原性较低，在细胞移植过程中具有较好的耐受性。但是目前关于干细胞定向分化为特定类型细胞的研究进展并不顺利，一方面，是分化效率较低，另一方面，是因为分化成熟度较差，分化完成的细胞移植后与机体并未在功能上形成一个有机的整体[19]。干细胞的增殖与分化处于动态平衡，因此抑制干细胞的增殖能力，可能有助于其分化[20]。染料木素已经报道能够抑制多种细胞的增殖，因此本研究旨在探索其在大鼠骨髓间充质干细胞中的作用。

结果证实染料木素能够抑制大鼠BMSCs的增殖。当使用染料木素处理细胞后，细胞倍增时间显著升高。在机制研究中，通过流式细胞术证实染料木素能够诱导细胞发生凋亡，该效应可能是通过上调Bax基因的表达同时下调Bcl-2的表达所致。Bcl-2和Bax是内源性线粒体凋亡途径中的关键分子，二者处于动态平衡过程中[21,22]。当二者的比例发生变化后，内源性凋亡途径被激活，细胞启动凋亡过程[23,24]。我们的结果与先前的研究相符。

总之，本文证实染料木素能够抑制大鼠骨髓间充质干细胞的增殖，该效应与其调节了内源性线粒体凋亡途径Bcl-2和Bax蛋白的表达水平相关。这可能有助于大鼠骨髓间充质干细胞分化为特定类型的细胞，值得进一步研究。