崔 杰，李俊良，王琮玉，代翠红，刘俊利，刘天娇

(哈尔滨工业大学 化工与化学学院，哈尔滨 150000)

0 前 言

抗冻蛋白(antifreeze protein, AFP)是20世纪60年代从极地海鱼的血清中发现的一种具有阻止体液内冰核形成与生长、维持体液的非冰冻状态的高效抗冻活性物质[1]。按照来源抗冻蛋白可分为三种：鱼类抗冻蛋白、昆虫抗冻蛋白和植物抗冻蛋白。与鱼类和昆虫afp基因相比，植物afp基因的研究相对较晚。1992年，Griffith等第一次明确提出获得植物内源AFP，他们从经过低温锻炼的能够忍受细胞外结冰的冬黑麦叶片中提取并纯化了该蛋白，在该蛋白浓度为60 mg/ml、温度为-1.1℃时，可观察到双锥体或针状冰晶[2]。同年，费云标等先后以不同的方法首次从雪莲和沙冬青中分离和部分纯化了AFP，经测定其冰点降低和热滞活性均高于在冬黑麦中已获得的AFP的活性，在50 mg/ml的浓度下，其熔点约为-15℃，抗冻活性比已经发现的鱼类或黑麦都高很多[3]。陆续，有很多相关研究报道了胡萝卜afp基因抗冻利用研究[4]。

甜菜是我国主要的糖料作物，在东北、华北、西北地区大面积种植。虽然与冷敏感植物相比，甜菜是一种比较耐寒的作物，但早春的晚霜和秋季的早霜冻害对甜菜苗期和糖分积累期的生长影响严重。因此，培育耐寒抗冻甜菜品种对北方甜菜的生产意义重大。本研究采用PCR方法从3种胡萝卜中克隆了抗冻蛋白基因afp，经测序比对、选择其中一个基因通过构建安全、环保的甜菜叶绿体表达载体，并利用基因枪法转化甜菜叶柄，经诱导分化、抗性筛选及对抗性植株PCR检测，获得了具有抗冻蛋白基因的转基因植株，为快速培育耐寒抗冻甜菜品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 植物材料

胡萝卜精选三红五寸参(黑龙江哈尔滨地方品种)，日本黑心田五寸参(山东昌邑地方品种)及西北胡萝卜(西北地方品种)；甜菜为哈尔滨工业大学甜菜课题组自育的二倍体品系72-204。

1.1.2 菌株和质粒

大肠杆菌DH5α为本课题组保存。pBM18-T Vector购自TAKARA公司，p16APT(含有叶绿体特性启动子Prrn和终止子TpsbA)，pSAR(含有甜菜叶绿体同源片段atpB/rbcL)均由该实验室构建及保存[5]。

1.2 实验方法

1.2.1 胡萝卜基因组DNA的提取

采用CTAB提取法。

1.2.2 PCR扩增

根据GenBank上afp基因的序列，设计引物，如下：

P1：5’-CGGGGTACCATGAATATTGAATCATC-3’

P2：5’-CGGACTAGTCTAGCATTCTGGCAATG-3’

以胡萝卜基因组DNA为模板，反应条件：95℃ 5 min→(95℃ 1 min→55℃ 1 min→72℃ 3 min)30个循环→72℃ 10 min。

1.2.3 载体构建

目的片段经回收、连接、转化大肠杆菌、检测；测序由华大基因生物技术公司完成；表达载体构建，将克隆的片段经过一系列分子生物学手段构建成表达载体，包含甜菜叶绿体基因组同源序列、外源基因表达盒和筛选标记基因表达盒。

1.2.4 基因枪法转化甜菜

构建的表达载体采用基因枪法转化甜菜叶柄，经组织培养、分化、抗性筛选、检测。

2 结果与分析

2.1 胡萝卜afp基因的克隆与序列分析

分别以提取的三种胡萝卜基因组DNA为模板，采用afp基因特异引物进行PCR扩增。电泳结果表明：PCR产物大小约1.0 kb，与预计的相符。见图1。

M：DL2000 Marker；1：三红胡萝卜；2：日本胡萝卜；3：西北胡萝卜图1 afp基因PCR扩增产物

分别将三个目的片段克隆到pBM18-T Vector载体上，转化大肠杆菌。在含有氨苄霉素的LB培养基上筛选、获得阳性重组质粒pBM18-afp。酶切鉴定载体构建正确。见图2。

M：DL2000Marker；1,2:Kpn/BamHⅠ单酶切(三红胡萝卜)；3,4:KpnⅠ/BamHⅠ单酶切(日本胡萝卜)；5,6:KpnⅠ/BamHⅠ单酶切(西北胡萝卜)图2 克隆载体pBM18-afp酶切鉴定

经测序、序列分析表明：克隆片段全长999 bp，编码332个氨基酸。与报道的核苷酸序列GeneBank(GI：6740789)比较，afp1(三红胡萝卜)、afp2(日本胡萝卜)、afp3(西北胡萝卜)的核苷酸序列与其同源性分别是100%、99.8%、99.9%。其中，afp2第396位碱基C→T，第771位碱基C→A，其对应氨基酸变化为苏氨酸→苏氨酸，苯丙氨酸→亮氨酸；afp3第121位碱基A→T，其对应氨基酸变化为赖氨酸→终止子。本研究选用afp1进行载体构建及转化实验。

2.2 afp基因甜菜叶绿体表达载体的构建

2.2.1 中间载体的pSARAPT构建

用BamHI对载体p16APT进行酶切，回收2000 bp大小的片段(包括外源基因表达盒和aadA筛选标记基因表达盒)，与经相同酶切、回收的同源片段载体pSAR连接，转化大肠杆菌，筛选获得中间载体pSARAPT。见图2-3。

P：启动子Prrn；T：终止子TpsbA图3 中间载体pSARAPT的结构图

中间载体pSARAPT酶切鉴定，构建正确，见图4。

M：λ/HindⅢ Marker；1：KpnI；2：HindIII；3：SpeI；4：XbaI图4 中间载体pSARAPT的酶切鉴定

2.2.2 甜菜叶绿体表达载体pSARAfp的构建

用KpnI酶切重组质粒pBM18-afp，回收1000 bp片段，补平后与经SmaI酶切、去磷酸化回收后的中间表达载体pSARAPT连接，转化大肠杆菌，筛选获得阳性重组质粒 pSARAfp。见图5。

甜菜叶绿体表达载体pSARAfp酶切鉴定图谱如图6所示。结果表明：载体构建正确。

2.3 基因枪法转化甜菜及转基因再生植株获得

将包埋有金粉的载体质粒按操作规程转化甜菜叶柄，转化后的外植体先置于MS培养基上预培养 (图7A)，然后转入含有抗生素的分化培养基中，经诱导分化出芽(图7B)，继代与抗性筛选，获得绿色抗性再生植株(图7C)，抗性植株在生根培养基中长出根系(图7D) ，共获得10株。

图5 甜菜叶绿体表达载体pSARAfp结构图

M：λ/HindⅢ Marker；1：SpeI；2：HindⅢ；3：KpnⅠ图6 中间载体pSARAPT的酶切鉴定

图7 甜菜叶绿体转化与再生植株获得

2.4 转基因再生植株的分子检测

2.4.1 转基因甜菜基因组DNA提取

采用CTAB法提取转基因再生植株基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图8所示。可用于下一步的分子检测。

图8 转基因甜菜基因组DNA

2.4.2 转基因植株中外源基因的PCR检测

以上述提取的基因组DNA为模板，以胡萝卜基因组DNA为阳性对照，以野生型甜菜为阴性对照，PCR扩增，产物经电泳检测，结果如图9所示。

M：DL2000 Marker；1：阳性对照；2：阴性对照；3-6：转基因抗性植株图9 转基因植株的PCR检测

从图中可以看出，阴性对照和6号泳道无产物扩出，其余均获得扩增产物，且PCR扩增产物大小均为1000 bp左右，与预期结果相吻合。3号、4号、5号泳道对应于1#、2#、3#抗性植株，说明三个植株为阳性。6号泳道对应4#抗性植株，无产物扩出，说明这个植株为假阳性。

3 讨论

胡萝卜属(DaucusL.)约有60种，分布于欧洲、亚洲、非洲和美洲，我国有两种，野胡萝卜DaucuscarotaL.和变种胡萝卜D.carotaL.var.sativaDC(中国科学院西北植物研究所)，该变种即我国大面积种植的栽培种。GeneBank上的胡萝卜材料和我国的栽培钟属于同一种内的不同变种(Smallwood M，1999)，两变种长期隔离，处于不同的生态环境中。本研究考虑到我国各个地方气候和环境差异，选用不同地域的三个主栽品种为材料，其afp基因保持了很高的种内同源性(99.8%以上)，说明afp基因相对保守。

叶绿体转化技术以其安全、环保、高效表达等优势已经在烟草、水稻、衣藻、苜蓿等作物中应用，并获得成功。我们课题组也利用植物叶绿体基因组在进化中高度保守的特点，构建了甜菜叶绿体遗传转化体系，并成功的将抗虫Bt基因CryIAc及抗除草剂bar基因转化甜菜获得转基因再生植株及后代种子[5]。本研究就是利用自行建立的甜菜叶绿体转化体系又一次成功的将抗冻蛋白基因转化甜菜，目的是为选育甜菜抗冻品种创制种质材料，以其尽早选育出耐寒品种为生产服务。由于多数作物叶绿体基因组序列未知，所以目前叶绿体转化技术应用仍然仅限于较少的植物，开发新物种的转化体系需要大量的工作[6,7]。

最近，有报道称已经开发了在植物之间转移转基因质体的更简单的方法。令人惊讶的发现了质体DNA(可能整个质体)可以在嫁接植物的细胞之间迁移。由于可以嫁接不相容性的植物，该方法允许通过嫁接位点 (在建立嫁接接合后)将转基因质体转移到不易转化植物的细胞中以完成植物之间的质体转化，这种方法可能有助于扩大叶绿体转化技术的物种范围，但其适用性将限于密切相关的植物。核基因组与新质体基因型的组合可能导致所谓的质体基因组不相容性，其随着系统发生距离的增加变得更可能，并且可能导致严重的突变表型。叶绿体转化除了在作物遗传改良上有着巨大的潜力，在植物生物反应器的发展上也有巨大作用，可持续且高效益地生产生物医药、生物酶以及化工原材料[8]。