张生杰，王 丽，田志梅

(武威市药品检验检测中心，武威 733000)

脑心通胶囊是由黄芪66 g、赤芍27 g、丹参27 g、当归27 g、川芎27 g、桃仁27 g、红花13 g、醋乳香13 g、醋没药13 g、鸡血藤20 g、牛膝27 g、桂枝20 g、桑枝27 g、地龙27 g、全蝎13 g、水蛭27 g十六味中药组成，取地龙、全蝎，粉碎成细粉；其余黄芪等十四味粉碎成细粉，与上述粉末配研，过筛，混匀，装入胶囊，制成[1]，具有益气活血、化瘀通络功效，用于气虚血滞、脉络瘀阻所致脑卒中中经络，半身不遂、肢体麻木、口眼歪斜、舌强语謇及胸痹心痛、胸闷、心悸、气短；脑梗死、冠心病心绞痛属上述症候者[1]。利用液质联用技术分析鉴定了脑心通胶囊178个成分，其中黄酮类21种，黄酮苷类6种，菲醌类18种，萜类22种奠定了其化学物质基础[2-3]。研究表明脑心通胶囊治疗急性缺血性脑卒中具有显著的疗效[4]，其临床功效主要是通过对脑保护、神经保护、心脏保护、血液流变学等相关环节的改善而发挥作用[5]。通过对脑心通胶囊“Q-markers”药材-化学成分-通路-靶点-疾病”网络构建的研究，找到了5个关键蛋白靶点和8条信号通路[6]。

中药复方制剂质量控制是影响临床用药安全的关键因素，其临床疗效由多种成分控制，协同发挥治疗作用，因此中药质量是保证中药复方制剂安全有效的核心。《中华人民共和国药典》(2015年版)仅以芍药苷、丹参酮ⅡA定量控制脑心通胶囊质量，现行标准测定指标较为单一，并未对主药黄芪、当归、川芎、红花、鸡血藤进行质量控制，因此建立符合中药配伍理论、有效成分和药效学的质量控制方法是有必要的。为此，目前主要通过建立指纹图谱分析方法和多成分同时测定来控制脑心通胶囊质量，通过HPLC-DAD建立的脑心通胶囊指纹图谱分析方法检出33个特征峰，其中13个特征峰明确其化学成分归属，可用于表征脑心通胶囊中化学成分信息，同时测定了黄芪甲苷、毛蕊异黄酮苷、羟基红花黄色素A、丹酚酸B含量[7-8]；利用HPLC-MS联用技术可以快速同时测定脑心通胶囊中12种成分[9-10]，但对仪器设备要求较高不能普遍使用；HPLC法作为常用定量分析方法被广泛应用于脑心通质量控制中[11-15]。李耿等[16]采用UPLC法同时测定脑心通胶囊中5个成分，韦湫阳等[17]通过微乳毛细管电泳法同时测定了芍药苷等4个成分，但都未建立起同时测定丹酚酸、丹参酮ⅡA(丹参)、阿魏酸(当归、川芎)、羟基红花黄色素A、山柰素(红花)、芍药苷(赤芍)、芒柄花素(黄芪、鸡血藤)7种指标成分的色谱方法。为更好地控制该产品质量，建立准确、快速、通用定量分析方法，本实验建立了HPLC-DAD波长切换法同时测定脑心通胶囊中7种指标成分的色谱方法，所建方法灵敏度高、稳定、适用于脑心通胶囊质量控制与评价。

1 材 料

1.1 仪 器

LC-20AD高效液相色谱仪、二极管阵列检测器(日本岛津公司)；MS105DU十万分之一电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；UA10MFD超声波清洗器(德国Wiggens公司)。

1.2 试 剂

对照品羟基红花黄色素A(批号：111637-201106，含量以92.5%计)、芍药苷(批号：110736-201438，含量以96.4%计)、阿魏酸(批号：110773-201012，含量以99.6%计)、丹酚酸B(批号：111562-201514，含量以93.7%计)、山柰素(批号：110861-201209，含量以93.2%计)、芒柄花素(批号：111703-200602，含量以99.3%计)、丹参酮ⅡA(批号：110766-201520，含量以99.8%计)均购于中国食品药品检定研究院；脑心通胶囊，规格：4×12粒/板/盒，陕西步长制药有限公司，批号171165、17101781、1711146、1710160、1707122、1711150、1712115、1710176、1711196、180178、170885、1708131、171159、171199、171254、1712158、1711145、1711135、1611106、1710160；乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯，其他试剂均为市售分析纯。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的制备

取对照品羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B、山柰素、芒柄花素、丹参酮ⅡA对照品适量，精密称定，用甲醇配成含羟基红花黄色素A 115.0 mg/L、芍药苷220.2 mg/L、阿魏酸61.05 mg/L、丹酚酸B 290.2 mg/L、山柰素58.10 mg/L、芒柄花素6.05 mg/L、丹参酮ⅡA 114.1 mg/L的混合对照品溶液储备液备用。

2.2 供试品溶液的制备

取脑心通胶囊20粒的内容物，精密称定，研细，取0.5 g，精密称定，置150 mL三角瓶中，加入75%甲醇约50 mL，称定，超声(300 W，50 kHz)处理30 min，放冷，75%甲醇补足，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 色谱条件

色谱柱为Capcell PAK C18MGⅡ色谱柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流动相为甲醇-乙腈(75∶25，A)-0.1%甲酸水溶液(B)梯度洗脱：0～10.0 min，95%B；10.0～16.0 min，95%～85% B；16.0～18.0 min，85% B；18.0～22.0 min，85%～75% B；22.0～26.0 min，75%～65% B；26.0～40.0 min，65%～15% B；40.0～55.0 min，15% B；取羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B、山柰素、芒柄花素、丹参酮ⅡA对照品对照品溶液，稀释，用DAD检测器在190～400 nm范围对上述对照品进行光谱扫描，结果羟基红花黄色素A在403 nm处有最大吸收、芍药苷在230 nm处有最大吸收、阿魏酸在316 nm处有最大吸收、丹酚酸B在286 nm处有最大吸收、山柰素在403 nm处有最大吸收、芒柄花素在248 nm处有最大吸收、丹参酮ⅡA在270 nm处有最大吸收，故选择测定波长：240 nm(芍药苷、芒柄花素)、280 nm(丹酚酸、丹参酮ⅡA)、316 nm(阿魏酸)、403 nm(羟基红花黄色素A、山柰素)，见图1。体积流量1.0 mL/min，柱温30 ℃；进样量20 μL。

Figure1 Gradient elution and wavelength switching program of HPLC

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性考察 取溶剂空白、对照品溶液、供试品溶液，按照“2.3”项下色谱条件进行测定，结果供试品中各待测成分色谱峰的分离度均大于1.5，其他杂质峰对待测成分均无干扰，见图2。

2.4.2 线性关系、检出限和定量限 依次精密吸取混合对照品储备液5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 μL，按照“2.3”项下色谱条件分别进样测定，以峰面积(y)为纵坐标，质量浓度(x)为横坐标进行线性回归，得回归方程。倍比稀释混合对照品储备液进样分析，以信噪比S/N=3计算检出限(LOD)，信噪比S/N=10计算定量限(LOQ)。结果见表1。

2.4.3 精密度试验 取脑心通胶囊(批号171165)供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件，连续进样6次，测定峰面积。结果表明羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B、山柰素、芒柄花素、丹参酮ⅡA峰面积的RSD(%)分别为0.98、0.68、1.27、1.31、0.85、0.97和1.06，表明精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液(批号171165)，分别于2、4、6、8、12、24 h，按“2.3”项下色谱条件测定峰面积。结果供试品溶液在24 h内色谱峰面积无明显变化，羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B、山柰素、芒柄花素、丹参酮ⅡA的RSD分别为0.71%、1.15%、1.08%、1.36%、1.71%、1.24%、1.48%，表明供试品溶液在制备后24 h内稳定性良好。

Figure2 HPLC chromatograms ofNaoxintongcapsule sample (a) and reference substances (b) at 240 nm (A),280 nm (B),316 nm (C) and 403 nm (D)

1:Hydroxysafflor yellow A;2:Paeoniflorin;3:Ferulic acid;4:Salvianolic acid B;5:Kaempferol;6:Formononetin;7:Tanshinone IIA

Table1 Linear range for peak area-concentration of seven components

Componentλ/nmLinearrange/(mg/L)RegressionequationrLOD/(mg/L)LOQ/(mg/L)HydroxysaffloryellowA4032.30-11.50y=44867x-470.70.99920.220.44Paeoniflorin2408.81-44.05y=20546x+4075.10.99961.767.05Ferulicacid3161.22-6.10y=96559x-2390.50.99960.301.07SalvianolicacidB28011.61-58.05y=17395x-1238.90.99940.584.64Kaempferol4031.16-5.80y=81954x-5083.00.99940.230.92Formononetin2400.12-0.60y=124118x-247.80.99950.060.12TanshinoneIIA2802.28-11.40y=48964x+4612.00.99950.141.14

2.4.5 重复性试验 脑心通胶囊(批号171165)，平行取样6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，测定各成分含量。结果羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B、山柰素、芒柄花素、丹参酮ⅡA含量平均值分别为0.362、2.485、0.189、2.841、0.181、0.022、0.473 mg/g，RSD(%)分别为1.20、0.56、0.93、0.85、1.55、1.75和1.44。

2.4.6 加样回收率试验 取已知含量的脑心通胶囊(批号1708131)样品27份，每份约0.50 g，精密称定，分别精密加入对照品溶液适量分高、中、低3组，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样，记录色谱峰面积，计算回收率。结果见表2。

Table2 Recovery of seven index components inNaoxintongcapsules (n=3)

ComponentContent/mgAdded/mgFound/mgAveragerecovery/%RSD/%HydroxysaffloryellowA0.1430.3460.2300.1150.4880.3690.25698.890.71Paeoniflorin0.7681.1010.6610.4401.8761.4411.210101.020.69Ferulicacid0.0830.1830.1220.0610.2600.2020.14297.590.74SalvianolicacidB1.2891.1600.5800.2902.4311.8541.57598.300.69Kaempferol0.0670.1740.1160.0580.2360.1810.12498.300.80Formononetin0.0110.0180.0120.0060.0290.0230.01797.350.93TanshinoneIIA0.2400.3420.2280.1140.5730.4610.35297.800.77

2.5 样品测定

取20批脑心通胶囊样品，每批按“2.2”项下方法分别制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样测定，采用外标法计算。结果见表3。

Table3 Determination of seven index components inNaoxintongcapsules (n=2)

BatchNo.HydroxysaffloryellowA/(mg/g)Paeoniflorin/(mg/g)Ferulicacid/(mg/g)SalvianolicacidB/(mg/g)Kaempferol/(mg/g)Formononetin/(mg/g)TanshinoneIIA/(mg/g)1711650.3622.4850.1892.8410.1810.0220.473171017810.3691.7360.1762.8410.1790.0220.48617111460.3662.6880.1662.8910.1780.0260.48817101600.3623.0040.2232.8250.1750.0230.48017071220.3662.7450.2162.8970.1630.0240.48917111500.3641.5480.2262.7910.1680.0240.69817121150.3252.4320.1822.9820.1640.0250.49917101760.3113.2170.2362.8660.1570.0250.48617111960.3312.5520.2253.2530.1520.0260.6141801780.3282.3510.2143.0460.1320.0280.5921708850.2972.4630.1963.1070.1250.0280.57617081310.2861.5350.1652.5770.1340.0220.4791711590.2861.6260.2132.5630.1230.0280.4681711990.2381.6060.222.6420.1160.0270.4721712540.2882.5030.1983.2710.1350.0260.63217121580.2172.1440.1532.9170.1250.0230.49217111450.2132.4050.2013.0810.1130.0250.53217111350.2963.2090.2352.8560.1080.0280.46616111060.2132.7700.1733.0140.1030.0250.52817101600.2323.0040.1832.8320.1130.0250.471

2.6 数理统计分析

采用Minitab18.0统计软件对20批次脑心通胶囊测定数据进行数理统计分析。以95%的置信度，对羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B、山柰素、芒柄花素、丹参酮ⅡA测定结果进行Anderson-Darling正态性检验，结果见表4。

Table4 Mathematical statistical analysis of the content of seven index components inNaoxintongcapsules

ComponentPNμ/(mg/g)σ95%Confidenceinterval/(mg/g)HydroxysaffloryellowA0.057200.3020.0560.277-0.329Paeoniflorin0.111202.4010.5452.146-2.656Ferulicacid0.432200.1990.0250.188-0.211SalvianolicacidB0.362202.9050.1912.815-2.994Kaempferol0.088200.1420.0260.130-0.155Formononetin0.197200.0250.0020.024-0.026TanshinoneIIA<0.05200.5210.066-

3 讨 论

3.1 流动相的选择

在多指标成分分析时，色谱条件的选择是关键。在文献资料的基础上[6-8]，比较了不同品牌色谱柱在甲醇-水、甲醇-乙腈-水、甲醇-乙腈-磷酸-水、甲醇-乙腈-甲酸-水构成的洗脱体系，等度、梯度洗脱，发现采用资生堂色谱柱，甲醇-乙腈-甲酸-水梯度洗脱对7种指标成分的分离效果较好，各色谱峰的系统适用性均符合要求。采用DAD检测器在190～400 nm范围内对7种指标成分进行光谱扫描，鉴于所测7个成分的最大吸收波长相差较大，样品中含量较低的成分限制了波长的选择，为保证各成分在最大吸收波长处检测，提高灵敏度，减少干扰，故采用波长切换法，确定了7种成分的检测波长240 nm(芍药苷、芒柄花素)、280 nm(丹酚酸、丹参酮ⅡA)、316 nm(阿魏酸)、403 nm(羟基红花黄色素A、山柰素)。

3.2 方法学考察

在考察方法专属性时，未采用阴性样品对照，主要是因脑心通胶囊处方药材种类多，几种药材含同一种化学成分，容易出现假阳性干扰结果，如黄芪、鸡血藤中均含有芒柄花素，当归、川芎中均含有阿魏酸。本实验通过DAD检测器采集到3D谱图，比对样品中各测定成分与相应对照品的光谱图，以验证测定方法的专属性，操作快捷且能够准确反映方法的专属性，为以后研究复杂配方制剂分析方法的专属性提供了新的途径。

3.3 检测方法分析

本实验采用波长切换法实现了在同一色谱条件下，多指标成分在各自最大吸收波长下测定其含量，避免了干扰组分对待测物质测定的影响，对样品中多指标成分含量的高灵敏检测，相比文献报道[8，16]增加了山柰素、芒柄花素、丹参酮ⅡA的测定，山柰素作为红花指标成分因不同产地、不同采收期对其含量影响较大[18-19]，芒柄花素是《中华人民共和国药典》鸡血藤薄层鉴别的指标成分，但药典中缺少含量测定的方法，丹参酮ⅡA是丹参主要药理成分，具有抗动脉粥样硬化、抗心室肥厚、抗氧化、抗心律失常等作用[20]，增加这3种指标成分的测定对控制脑心通胶囊质量的稳定、全面评价其质量具有非常重要的意义。

3.4 质量分析

通过对20批次脑心通胶囊中7种成分含量数理统计分析，发现不同批次样品之间羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B、山柰素、芒柄花素含量符合正态分布，Anderson-Darling正态性检验，P均大于0.05，说明批次间无明显差异，本品的工艺控制水平比较稳定。丹参酮ⅡA检测结果不符合正态分布，可能是由于分析样品数量较少不能完全体现整体特征，其次不同产地丹参药材丹参酮ⅡA含量有差异[21]，丹参药材不同部位丹参酮ⅡA含量有显著差异[22]，丹参酮ⅡA的热不稳定[23]，造成了脑心通胶囊中丹参酮ⅡA含量的差异。因此厂家采购药材和储存原料时，需严格把控药材质量，从药材源头进行控制，确保制剂质量的稳定，实现对产品质量的源头控制。本实验所建立的HPLC同时测定脑心通胶囊中7种指标成分含量的方法，为实现质量控制的数字化、提高产品质量、全面评价脑心通胶囊质量提供可行的有效途径。