胡帅帅，张 珉，肖叶懿，陈 阳，鲍国连，吴信生

(1.扬州大学 动物科学与技术学院，江苏扬州 225009；2.浙江省农业科学院 畜牧兽医研究所，杭州 310021)

獭兔是一种重要的毛皮动物，其毛皮具有“短、平、细、密、美、牢”等优点，被毛颜色丰富多彩，纯天然的被毛不掉色或褪色，在制成服装等制品前不需染色，不会对环境和消费者健康造成不良影响，深受消费者青睐，国内市场上天然彩色獭兔皮毛供不应求[1]。美国认可的獭兔毛色有14种，欧洲认可的有30种，而中国以青紫蓝色、黑色、海狸色、白色獭兔为主。目前，国内外对獭兔毛色的研究越来越重视，在生物学及医学领域具有重要的研究价值。

黑色素是一种生物色素，存在于动物、植物以及原生生物中。天然形成的黑色素包括真黑色素和脱黑色素(褐黑色素)，两者比例不同导致不同颜色的形成[2]。黑色素是由黑色素细胞分泌，并通过特定的转运方式传送到细胞外，在相关组织中进行沉积，形成黑色素颗粒[3]。多巴是黑色素形成的前体物质，经过一系列反应进而生成黑色素。动物的皮毛色以及植物的不同颜色都是由黑色素的种类、数量及分布情况所决定的。人类表皮中黑色素在人类的进化和生理过程中起着重要的作用[4]。有研究发现，在雄性和雌性鸟类中真黑色素和褐黑色素的比例不同会导致羽毛不同部位的颜色不同[5]。也有研究发现，由于黑色素的转氨酶对性别和年龄比较敏感，导致乌骨鸡母鸡明显比公鸡黑[6]。

在黑色素合成过程中，黑色素合成的限速酶-酪氨酸酶(Tyrosinase, TYR)是不可缺少的。酪氨酸酶是黑色素合成过程中关键的氧化还原酶，与生物体合成色素直接相关，真黑素色和褐黑色素比例不同主要是由酪氨酸酶催化酪氨酸的反应所决定的[7]。在黑色素合成过程中，首先是黑色素细胞中酪氨酸在酪氨酸酶的催化下生成多巴，多巴经过酪氨酸酶的进一步氧化，生成多巴醌，随后多巴醌通过不同途径分别生成真黑色素和褐黑色素。由于酪氨酸酶可以决定黑色素的产生，因此TYR基因的表达对黑色素的调控至关重要。有研究发现，TYR基因的多态性可显著影响云南乌骨绵羊的毛色形成[8]，并且与家鹅羽毛色显著相关[9]。还有研究证明，TYR基因及蛋白在棕色羊驼个体中的表达水平显著高于白色羊驼[10]。除此之外，TYR基因在企鹅的黑色素合成及颜色形成中也发挥着至关重要的作用[11]。

毛囊是皮肤重要的附属器官，是可再生的，具有复杂的形态和结构，由上皮组织和真皮组织组成，是毛发的加工厂。而毛发的大小和形状是由位于毛囊底部的特殊的成纤维细胞组成的毛乳头决定的，而毛发的颜色则是由散布在基质细胞之间的黑色素细胞产生的色素所决定的[12]。毛囊一般都是成群分布的，并且毛囊具有周期性。简单来说，在其生长过程中，毛囊经历了快速生长期(生长期)、退化期以及相对“静止期”(休止期)，其依靠上皮细胞和真皮间充质细胞的相互作用，从而完成周期性生长，发育成完整的毛囊[13]。完整的毛囊分为初级毛囊和次级毛囊。初级毛囊发生在毛囊生长的早期，其主要作用是生长粗毛。而次级毛囊发生在毛囊形成的后期，由初级毛囊分化形成，其主要生长绒毛。毛囊周期性变化对被毛的生长与脱落具有一定的调节作用[14]。毛囊发育的周期性不仅受光照、温度及紫外线等物理因素的调控，还受相关基因及相关通路的调控。有研究发现，在青山羊中，表皮生长因子(EGF)基因的表达水平与次级毛囊直径的大小显著相关[15]。还有研究证明，BMP信号通路对初级毛囊和次级毛囊的周期发育具有显著影响[16]。毛青青等[17]研究了BMP4对小鼠毛囊数量的影响，发现干扰BMP4的表达小鼠毛囊数量会显著增加。Alonso等[18]的研究展现了人和小鼠不同时期的毛囊形态特征，以及黑色素细胞的活性规律，提示毛囊数量和结构与其皮毛产量和质量有密切关系。

目前，关于动物黑色素沉积以及毛囊周期性变化的相关研究主要集中在小鼠[19]、乌骨鸡[20]、貂[21]以及羊等动物中。黑色素存在于毛囊的毛乳头及皮肤的表皮层中，有研究证明，毛乳头中的黑色素和表皮层中的黑色素不同，前者与毛发周期紧密结合，而后者黑色素的生成是连续的[22]。在毛囊生长期，黑色素细胞亚群呈现不同程度的凋亡和存活[23-24]。并且还有研究证明，表皮黑色素细胞可以作为毛囊黑色素细胞参与毛囊的再生[25]。然而，在獭兔中，动物黑色素沉积和毛囊的周期变化却鲜为人知。本试验通过构建家兔的拔毛模型，使毛囊再生，定期采集皮肤组织，采用石蜡切片技术，在光学显微镜下观察不同毛色獭兔皮肤中黑色素沉积与毛囊发育规律，分析毛囊发育周期与黑色素沉积的相关性，并分析黑色素生成的关键基因TYR在此期间的表达变化情况，旨在研究不同毛色成年獭兔在毛囊周期性变化过程中黑色素沉积与毛囊发育规律的相关性，为进一步探究獭兔毛色的形成机制奠定基础，同时为培育彩色獭兔新品系和生产中獭兔科学采皮提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

选择2月龄左右獭兔：黑色獭兔、白色獭兔、青紫蓝獭兔、海狸色獭兔、蛋白青色獭兔以及蛋白黄色獭兔各3只，随机分成6组。严格遵守试验动物福利原则，将獭兔固定，随后耳缘静脉注射戊巴比妥钠进行麻醉，用手把靠近尾巴背部两侧的毛拔掉，所拔毛的面积大约是5 cm × 5 cm，随后用酒精擦拭干净，用高压灭菌镊子夹住皮肤，然后用剪刀慢慢剪开，剪取2 cm × 2 cm皮肤，伤口及时用碘伏处理。所剪下的皮肤分成2份：一份放入φ=4%的多聚甲醛中，用于石蜡切片制作；另一份放入-80 ℃的冰箱中保存，用于蛋白提取。以拔毛当天为第0天，试验周期为35 d，分别在第7天、第14天、第21天、第28天和第35天进行相同步骤的样品采集。

1.2 试 剂

正丁醇、无水乙醇、二甲苯、黑色素染液试剂、中性树胶载玻片。

1.3 石蜡切片的制作

将切片依次放入二甲苯 Ⅰ(20 min)-二甲苯 Ⅱ(20 min)-无水乙醇 Ⅰ(5 min)-无水乙醇Ⅱ(5 min)-φ=75%的酒精(5 min)-水洗。切片浸泡到银氨液内，加盖放于暗处，反应12～ 18 h (4 ℃)，蒸馏水洗3遍，φ=5%的硫代硫酸钠处理2 min，流水冲洗5 min，去除未反应的银离子。VG染色(苦味酸-酸性品红染色)复染。无水乙醇快洗。将切片放入二甲苯 Ⅰ(5 min)-二甲苯 Ⅱ(5 min)中脱水至透明，取出切片，晾干后选用中性树胶进行封片。显微镜下观察，黑色素、亲银细胞胞质呈黑色，胶原纤维呈红色，肌纤维和红细胞呈黄色，判读结果。

1.4 组织蛋白的提取

取组织50～100 mg，冰上剪碎。加入预冷的RIPA 裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)0.5～1 mL。数次匀浆(玻璃匀浆器)，直至细胞破碎；冰浴10 min，与此同时，用漩涡振荡器振荡5 min；4 ℃ 12 000 g 离心10 min，将上清液转至新的离心管，从而得到组织的总蛋白产物。

1.5 蛋白质量浓度的测定

取适量的25 mg/mL蛋白标准溶液，加入适量的磷酸盐缓冲液，配制成0.5 mg/mL的蛋白标准品。按照0、1、2、4、8、12、16和20 μL，将标准品依次加入96孔板的标准品孔中，再滴加磷酸盐缓冲液补足至20 μL。此时，标准品的质量浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4和 0.5 mg/mL。取20 μL制备好的不同毛色獭兔皮肤组织蛋白样品，放入96孔板的标准品孔中。据样品数量，配制适量BCA工作液(试剂A与试剂B体积比例为50∶1)，充分混匀，加200 μL BCA工作液到各孔中，37 ℃放置20～30 min。随后用酶标仪测定A562处的吸光度，进行蛋白质量浓度的测定。根据各孔标准品质量浓度及所得吸光值制作标准曲线，并根据样品体积计算出不同样品的蛋白质量浓度。

1.6 Wes 全自动蛋白表达分析试验

取出Wes Separation 12～230 ku 8×25 capillary cartridges试剂盒中的Standard Pack 1试剂置于冰上；向含有白色 dTT 粉末的指型管内加入 40 μL 去离子水，吹打均匀，即为dTT溶液；向装有粉色Master mix粉末的透明管内加入 20 μL dTT溶液和20 μL 10×Sample buffer，不断吹打至均匀，即为5×Master mix；白色管内加入16 μL离子水、2 μL dTT 溶液和2 μL 10×Sample buffer，吹打均匀，吸出10 μL左右放到空的 0.6 mL管内待变性； 1个孔需要5 μL样品(加入Master Mix的)，为了防止变性时的蒸发，建议 1 个孔配 1.5 个孔的量，假设样品浓度为y，配制1个孔所需体积量如表1所示；一抗用 Antibody diluent Ⅱ稀释后放在冰上待用；二抗即开即用，无需配制；取Lumino-S 和 Peroxide 各150 μL配制发光液，涡旋振荡混合，放在冰上待用；随后将配制好的试剂依次加入板内，试验完成后分析 结果。

表1 每孔上样量Table 1 Loading quantity of samples per well

2 结果与分析

2.1 拔毛后不同毛色獭兔皮肤毛囊的再生情况

为了观察不同毛色獭兔皮肤组织不同时期毛囊在皮肤中的位置分布情况，通过石蜡切片技术，利用黑色素染色方法进行染色，通过光学显微镜对切片进行观察。结果发现，不同毛色獭兔的毛囊均分布在皮肤组织的真皮层中，由于毛囊处在不同时期，所以不同毛色獭兔皮肤中不同时间点的毛囊深度均不同。彩色獭兔毛囊周期在35 d左右。7～21 d，毛囊处于生长期，此阶段毛囊结构完整，并且清晰可见初级毛囊和次级毛囊。 21～28 d，毛囊由生长期进入退化期，毛囊不完整，毛干开始脱落，毛囊深度变浅。35 d左右时，毛囊处于休止期，毛囊群结构松散，并且初级毛囊和次级毛囊数量减少，形态模糊(图1，图2)。

2.2 拔毛后不同毛色獭兔皮肤黑色素生成分析

使用黑色素染色方法进行切片染色，结果发现在不同时期，不同毛色獭兔皮肤组织黑色素含量变化趋势均一致，7 ～21 d逐渐增多，28～35 d逐渐减少。结果表明，不同毛色獭兔皮肤中黑色素沉积量均在第21天达到最高(图2)。

2.3 拔毛后不同毛色獭兔皮肤TYR蛋白表达水平分析

已知TYR是动物体黑色素细胞中黑色素合成的限速酶，该基因的表达对黑色素含量有一定的调控作用。根据“2.1”和“2.2”的研究结果，选取拔毛后第7天、第21天、第35天3个时间点，利用Wes 全自动蛋白表达分析仪，检测TYR蛋白在不同毛色獭兔皮肤组织的蛋白表达水平。使用GAPDH作为内参抗体进行蛋白定量分析。结果表明(图3)，TYR蛋白在不同时期不同毛色的皮肤组织中均有表达，且均在第21天表达水平最高，3个时间点表达量差异不显著(P>0.05)(图3)。

WH.白色 White; BL.黑色 Black; BR.海狸色 Beaver color; CH.青紫蓝色 Cyan blue; PY.蛋白黄色 Protein yellow; PC.蛋白青色 Protein cyan;▲表示毛囊中黑色素颗粒 Melanin particles in the hair follicle.下同 The same below

图1 不同时期不同毛色獭兔皮肤组织石蜡切片纵切结果(40×)
Fig.1 Results of longitudinal paraffin sectioning of rabbits with different skin colors in different periods (40×)

图2 不同时期不同毛色獭兔皮肤组织石蜡切片横切结果(200×)Fig.2 Results of horizontal paraffin sectioning of skin tissue of rabbits with different coat color in different periods (200×)

图3 不同时期不同毛色皮肤组织TYR蛋白的相对表达量Fig.3 Statistics of relative expression ratio of TYR protein of skin tissues of different hair colors in different periods

3 讨 论

不同类别哺乳动物的毛囊发育均具有周期性，并且周期性变化是不同的。有研究证明，小鼠毛囊发育的生长期可分为0～8个阶段。从0阶段的诱导生长开始，在1阶段促进毛芽(胎盘)生长，在2阶段，表皮毛发生殖细胞开始增殖，随后在3～8阶段，毛囊方向确定以及毛干形成、生长[21]。本研究发现，彩色獭兔毛囊周期在35 d左右，大体上来讲，从第7～21天，毛囊处于生长期阶段；第21～28天，毛干开始逐渐脱落，毛囊由生长期进入退化期。到第35天时，毛囊结构不清晰，初级毛囊和次级毛囊模糊，毛囊处于休止期。张 艺[26]探究大鼠毛囊的生长周期，发现大鼠的毛囊生长周期为28 d，其中1～18 d为生长期， 19～22 d为退化期，23～28 d为静止期。本研究结果与大鼠毛囊生长周期基本一致。

黑色素分布于表皮层和毛囊中，但主要集中分布于毛囊中。黑色素含量及种类不同对不同毛色的形成具有重要影响。有研究发现，毛囊群越密集，其周围黑色素细胞越多，进而生成的黑色素含量越高[27]。本研究发现，獭兔皮肤中黑色素含量7 d～21 d逐渐增多，从第28天开始，到第35天逐渐减少。说明黑色素含量随着毛囊同期的变化而变化。有研究表明，在小鼠毛囊的生长初期和中期，其黑色素含量高于毛囊生长末期，与本文研究结果一致。在毛囊处于生长期时，黑色素沉积量相对较高，随着毛干的脱落，黑色素含量逐渐 减少。

酪氨酸酶是动物体内黑色素细胞产生黑色素过程中的限制酶。本研究中，在毛囊再生的第21天，即毛囊处于生长期时，TYR蛋白的相对表达水平高于第7天和第35天。赵兵令等[28]通过检测小鼠不同生长周期的黑色素含量，并且根据蛋白免疫印迹分析了黑色素相关蛋白MITF、TYR及TYRP2等的相对表对水平，发现在毛囊的生长初期和中期其黑色素含量及蛋白相关表达水平高于毛囊生长末期。与本研究结果基本一致。本研究结果中黑色素沉积量在第 21 天最高，与TYR蛋白的相对表达水平一致。

4 结 论

在不同毛色獭兔的皮肤组织中，毛囊均分布在皮肤组织的真皮层中，且不同时期毛囊深浅不一，拔毛后， 7 ～21 d，毛囊处于生长期； 21～ 28 d，毛囊由生长期进入退化期，28～35 d毛干逐渐脱落，在第35天左右毛囊处于休止期。不同毛色獭兔皮肤组织在不同时期黑色素含量不同，均在第21天黑色素含量沉积达到最高，第28～35天沉积量逐渐减少。在拔毛后第21天，黑色素合成的限速酶TYR蛋白在不同毛色獭兔皮肤中蛋白表达水平均最高，与黑色素沉积情况一致。