王玲仙，王 波，付 坚，邢佳鑫，肖素勤，张敦宇，钟巧芳，柯 学，陈 玲，殷富有，蒋 聪，程在全

(云南省农业科学院 生物技术与种质资源研究所/云南省农业生物技术重点实验室/农业农村部 西南作物基因资源与种质创制重点实验室，云南 昆明 650205)

野生稻资源是现代水稻育种中新基因的一个重要来源。特别是非AA染色体组野生稻这一次级基因库中有利基因的利用前景更为诱人，并已有成功的报道[1]。野生稻长期处于野生状态，经受各种病虫害和不利环境的自然选择，具有丰富的遗传多样性，是天然的基因库。在目前还不能大规模人工创造新基因的条件下，天然的野生稻资源在水稻育种中，特别是在抗病虫、抗逆性育种中具有巨大的利用价值[2]。同时野生稻还具有优质蛋白质含量高、功能叶片耐衰老、特强的再生性、良好的茂盛性及生长优势，这些优良特性已被广泛用于水稻常规育种和杂交育种中，并取得了巨大的社会效益和经济效益[3]。

紧穗野生稻Oryzaeichingeri经查证，认为O.eichingeri实际上是二倍体稻种， 有学者将其染色体组定为CC。它与栽培稻亲缘关系较远，同样具有许多优良特性，但紧穗野生稻结实率不高，种子落粒性强，萌发率低，基本不能用种子进行繁殖，严重妨碍了紧穗野生稻的保存保护、繁殖和利用。目前，紧穗野生稻的繁殖手段主要是茎秆扦插和分根移栽，其繁殖率低、繁殖时间长。研究中发现，紧穗野生稻种子种皮坚硬，有一层釉质包裹，种子极难吸水膨胀，造成种子萌发率极低，利用常规的浸泡和高温催芽处理也很难提高紧穗野生稻种子的发芽率，利用种子诱导愈伤效率和成苗率也极低。本研究利用紧穗野生稻的幼胚活力强的特点，应用不同植物激素组合和培养条件变化对其进行诱导分化，成功地诱导出了紧穗野生稻幼胚愈伤组织，并得到分化生根苗，为今后野生稻的资源保存、利用和杂交育种提供了技术支持和充分保障。

1 材料和方法

1.1 实验材料

紧穗野生稻种质材料从斯里兰卡引进。

1.2 实验试剂

2,4-D、6-BA、NAA、IAA、KT、ZT、TDZ与各类组织培养所用化学试剂均为国产分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 幼胚采集 田间采集紧穗野生稻幼胚，用纸袋装好，晒干，储存于干燥通风的地方。

1.3.2 幼胚处理 将晒干幼胚剥去壳，置于灭菌的小锥形瓶内，在超净工作台内用蒸馏水清洗，再用75%的酒精表面灭菌1 min，加入0.1%的氯化汞分别处理15、10 min，用无菌水清洗4～5遍，将种子用滤纸吸干水分，待用。

1.3.3 胚性愈伤诱导 将待用幼胚接入不同的诱导培养基上，置于人工气候箱28 ℃暗培养，35 d后，长出带有粘液的胚性愈伤，换培养基一次，继续培养10～16 d，使愈伤长至直径0.2 cm时，N6和MS愈伤诱导培养基为：N6和MS+2,4-D 3.0～15.0 mg/L+植物凝胶2.8 g/L+蔗糖30%, pH值6.0。

1.3.4 胚性愈伤继代培养 将直径0.2 cm的胚性愈伤从胚上分离下来，接入继代培养基中，置于人工气候箱中28 ℃暗培养，每20 d换培养基一次，继代2～3次后愈伤组织由白色变成淡黄色的紧实颗粒。愈伤继代培养基为：N6+2,4-D 3.0 mg/L+植物凝胶2.8 g/L+蔗糖30%, pH值6.0。

1.3.5 胚性愈伤增殖培养 挑选直径为0.2～0.5 cm的淡黄色紧实颗粒状愈伤组织进行增殖，每瓶接入20个愈伤，置于温度为28 ℃、光照为2000 lx的培养箱中进行弱光培养，每7 d更换一次培养基;21～28 d后；愈伤组织大量增殖覆盖整个培养基表面，并呈现黄绿色。愈伤增殖培养基为：N6+2,4-D 6.0 mg/L+植物凝胶2.8 g/L+蔗糖30%,pH值6.0。

1.3.6 胚性愈伤组织分化和继代培养 将黄绿色紧实颗粒状的愈伤组织分别接入不同分化培养基中，每瓶10～15个，置于温度为28 ℃、光照为4000 lx的培养箱中进行光照培养，10～12 d后，愈伤组织变为淡绿、深绿色相间，换继代培养基一次，继续培养20～25 d，换增殖培养基一次，25～30 d后，愈伤分化出小苗，待小苗长至2～3 cm长时，进行壮苗培养。分化、继代、增殖培养基为：N6+6-BA 2.0～12.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+KT 2.0 mg/L+ ZT 2.0 mg/L+植物凝胶2.8 g/L+蔗糖30%,pH值6.0。

1.3.7 壮苗培养 将2～3 cm长的小苗从培养瓶中取出，接入壮苗培养基中，置于28 ℃、4000 lx的光照培养箱中培养20～27 d，小苗茎秆增粗并长至4～5 cm时，进行生根培养。壮苗培养基为：N6+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+TDZ 2.0 mg/L+植物凝胶2.8 g/L+蔗糖30%，pH值6.0。

1.3.8 生根培养 将4～5 cm的健壮无根苗分别接入装有N6与NAA和IAA的生根培养基试管中，每根试管接入6～8株，置于28 ℃、2000 lx的弱光照培养箱中进行生根培养，3 d后根芽露白，培养20～25 d后，根长至5～7 cm，苗长至10～12 cm后进行炼苗；生根培养基分别为：N6+NAA和IAA 0.1～1.2 mg/L+植物凝胶2.8 g/L+蔗糖15 g/L，pH值6.0。

1.3.9 炼苗与栽种 将长至10～12 cm的生根苗揭掉试管膜，培养2 d后，用自来水将苗根部的培养基冲洗干净，放入试管中，加水淹没根部，置于28 ℃、2000 lx的光照培养箱中进行苗锻炼，5 d后，将苗从光照培养箱中移出，定植到购于市场的营养基质中，置于温室进行培养，12 d后，叶片完全展开、新根长出，再移栽至大田，在生长中期注意水、肥管理，后期注意追施一次肥，直至种子成熟。

2 结果与分析

2.1 不同诱导培养基对紧穗野生稻幼胚诱导愈伤情况的比较

以N6为基本培养基，设置不同的2,4-D浓度梯度，紧穗野生稻幼胚诱导愈伤情况如图1、表1所示。N6基本培养基在不加2,4-D的情况下(对照)，紧穗野生稻幼胚没有产生胚性愈伤。加入不同浓度2,4-D后，能够诱导出幼胚愈伤，当2,4-D浓度为5.0 mg/L时，对胚性愈伤诱导率最强，出愈率达到100%(图2)。此时愈伤颗粒紧实，浅绿，胚性愈伤生长情况最好。当2,4-D浓度为6.0 mg/L时，出愈率达到90%，愈伤颗粒紧实，淡黄、淡绿，胚性愈伤生长情况次之。当2,4-D浓度为15.0 mg/L，出愈率最低，只有26%，愈伤透明，粘性愈伤增多，品质下降。结果说明：2,4-D在一定浓度范围内诱导并促进了紧穗野生稻胚性愈伤组织的生长，但超过一定浓度之后，随着2,4-D浓度的不断增高，抑制了胚性愈伤生长，说明较低浓度和高浓度的 2,4-D不利于紧穗野生稻幼胚的愈伤组织诱导。

以MS为基本培养基，设置不同的2,4-D浓度梯度，紧穗野生稻幼胚诱导愈伤情况如图1、表1所示。MS培养基在不加2,4-D的情况下(对照)，幼胚没有产生胚性愈伤。当加入不同浓度2,4-D后，MS培养基与2,4-D的组合也能够诱导出幼胚愈伤，当2,4-D浓度为 7.0 mg/L时，胚性愈伤出愈率最高，达到30%，愈伤成颗粒状，淡黄淡绿相间；当2,4-D浓度为 15.0 mg/L时，胚性愈伤出愈率最低，只有10%，愈伤透明，粘性增多，说明当2,4-D浓度高时，在MS培养基中同样抑制了胚性愈伤形成。MS基本培养基与2,4-D配比整体来看，出愈率普遍偏低，愈伤粘性较多，不适合作为胚性愈伤的诱导培养基。

以上结果说明N6培养基比MS培养基更适合诱导紧穗野生稻的胚性愈伤，N6培养基+2,4-D浓度为5.0 mg/L时，愈伤诱导率最高，出愈率达到100%，此时愈伤颗粒紧实，浅绿，胚性愈伤生长情况最好。

图1 不同诱导培养基下紧穗野生稻幼胚愈伤组织诱导情况

图2 紧穗野生稻幼胚愈伤组织诱导培养

表1 紧穗野生稻在不同培养基中胚性愈伤的生长情况

2.2 不同激素配比分化培养基对紧穗野生稻幼胚分化影响比较

不同激素配比分化培养基对紧穗野生稻幼胚分化的影响如图3、表2所示。以N6为培养基，添加NAA 0.3 mg/L、KT 2.0 mg/L和ZT 2.0 mg/L情况下，设置不同的6-BA浓度梯度，均能够分化出苗。当6-BA浓度为4.0 mg/L时，愈伤分化率最高，达到88%(图4)；绿色凸起愈伤分化苗最多，苗油绿，茎秆粗，丛生苗多，长出新愈伤。当6-BA浓度为2.0 mg/L时，愈伤分化凸起增殖减慢，分化苗生长缓慢，用于分化继代培养较好。当6-BA浓度为2.0 mg/L时，添加NAA 0.3 mg/L、TDZ 2.0 mg/L，作为壮苗培养基最适合，壮苗后，苗油绿，叶片硬扎，茎秆粗壮，植株矮壮。当6-BA浓度为6.0 mg/L时，愈伤分化渐降，苗绿，而新愈伤和芽增多，作为分化增殖培养最理想；当6-BA浓度为12.0 mg/L时，愈伤分化率最低，只有2%，极少有分化苗，苗色黄绿，茎秆纤细，未见丛生苗和新愈伤长出，愈伤褐化，分化最差，不适合用于分化培养。

图3 不同激素配比分化培养基下紧穗野生稻幼胚分化情况

2.3 不同培养基对紧穗野生稻幼胚生根影响的比较

不同培养基对紧穗野生稻幼胚生根的影响如图5、表3所示，以N6为基本培养基，设置不同的NAA和IAA浓度梯度，均能够使紧穗野生稻幼胚分化苗生根。N6培养基与IAA的组合搭配，以IAA浓度为0.3 mg/L时，幼胚生根率最高，达到96%；3 d时根芽露白，根芽露白早，主根吸收养分充足，主根、须根生长快，根多、粗壮，用于生根最好(图6)。以IAA浓度为0.4 mg/L时，幼胚生根率次之，达到82%；3 d时根芽露白，主根粗、生长快，主须根分生次之。以IAA浓度为1.2 mg/L时，生根率最低，只达到15%；9 d以后根芽露白，主根生根减少，须根绒根曲卷，很难利用根系吸收足够的养分和水分来满足生根苗的生长需要。也就是说：当IAA浓度为 0.1～0.3 mg/L时，生根率随着激素浓度的提高而逐渐增高；当IAA浓度为0.3～1.2 mg/L时，生根率随着激素浓度提高而降低；当IAA浓度为1.0～1.2 mg/L时，由于激素浓度偏高，苗根基部严重褐化。

图4 紧穗野生稻幼胚分化培养

表2 不同6-BA浓度对分化培养基中愈伤分化的影响

N6培养基与NAA的组合搭配，当NAA浓度为0.3 mg/L时，5 d时幼胚根芽露白，主、须根出根增多，主根短，生根率最高，达到82%。当NAA浓度为0.4 mg/L时，7 d后幼胚主根长出，主根短、粗，须根长出、偏少，生根率次之，达到77%。当NAA浓度为1.2 mg/L时，9 d后根芽露白，主根生根减少，须根绒根曲卷，曲卷的须根不利养分和水分的吸收，因而满足不了根的生长需要，生根率最低，只达到23%。也就是说：当NAA浓度为0.1～0.3 mg/L时，生根率随着激素浓度的提高而逐渐增高；当NAA浓度为0.4～1.2 mg/L时，生根率随着激素浓度的增高而逐渐降低；当IAA浓度为1.2 mg/L时，苗根基部同样出现严重褐化。说明以N6为基本培养基时，设置不同的NAA和IAA的浓度配比，都能使紧穗野生稻幼胚分化苗生根。但是，IAA 较NAA更适合用于紧穗野生稻幼胚生根培养基。

2.4 炼苗、栽种与成活率

生根苗揭膜后，在培养箱中培养2 d，用自来水冲洗掉生根苗根部培养基，加水将根基部淹没，进行苗锻炼5 d，定植到营养基质中，在温室培养12 d，待叶片完全展开、新根长出，再移栽至大田生长20 d，统计苗的成活率。苗经过炼苗和栽种，组培苗和自然生长苗存在着很多差异，由室内环境过渡到室外，生长环境由无菌状态变成有菌状态，培养温度和光照条件发生了改变，整个炼苗和栽种，必须是一个逐步适应过程，这样有利于提高生根苗在田间的成活率。

图5 不同培养基下紧穗野生稻幼胚生根情况

3 结论

3.1 培养基的选择对紧穗野生稻幼胚愈伤组织诱导的影响

不同的培养基有不同的作用，分别可以诱导细胞分裂、控制愈伤组织生长和分化生根，选择适合的培养基是组织培养中最主要的因素。目前各种培养基无机盐的含量一般都比较高，对植物组织和细胞的离体培养适用性更好，由Murashige和Skoog设计的MS培养基各元素比例合理，对双子叶、单子叶、木本和草本的器官、组织、细胞及原生质体培养有良好效果。而N6培养基铵离子浓度较低，铵态氮和硝态氮比例合理，适合禾谷类的组织培养[4]。本研究中，通过N6和MS两种培养基筛选，确定了紧穗野生稻幼胚愈伤组织诱导以N6为基本培养基效果较好，出愈率高，愈伤颗粒紧实。这与张智奇等认为N6培养基比MS培养基更有效地促进水稻幼穗的愈伤组织诱导及植株再生的结果一致[5]。张尧忠等的研究结果也表明，愈伤组织在N6分化培养基的再生绿苗率高于MS培养基[6]。

图6 紧穗野生稻幼胚生根培养

表3 不同NAA和IAA浓度下紧穗野生稻幼胚生根苗的生长情况

3.2 激素对紧穗野生稻幼胚诱导愈伤组织产生的影响

植物生长调节剂是影响水稻胚性愈伤组织诱导和形成的关键因素之一，其中2,4-D是诱导水稻愈伤组织不可缺少的关键激素。不同植物外植体对2,4-D的浓度要求不同[7-8]。通过对7组不同浓度梯度的2,4-D比对发现，5.0 mg/L对紧穗野生稻胚性愈伤诱导最强，出愈率最高达到100 %。以2,4-D浓度为3.0 mg/L时用于愈伤继代培养较好。以2,4-D浓度为6.0 mg/L时用于愈伤增殖培养较好。2,4-D浓度过低和过高对胚芽启动效果很差，选择适宜的浓度比才是突破胚芽萌发的关键。

3.3 激素对紧穗野生稻幼胚分化成苗产生的影响

植物生长调节剂是影响愈伤组织再分化的关键性因素之一，细胞分裂素在组织培养中促进细胞分裂和分化，可促进植物细胞的分裂和不定芽的形成，打破顶端优势形成丛生芽，有利于芽的增殖和继代培养[9-11]。6-BA是诱导水稻愈伤组织再生植株时常用的细胞分裂素[12]。周玲艳等认为，6-BA有利于水稻愈伤组织的分化[13]。本实验结果表明：添加6-BA 4.0 mg/L，愈伤绿色凸起最多、分化最繁盛。选择生长素NAA与一定比例的细胞分裂素诱导腋芽及不定芽的产生，也是相符合的[14]。王力等[15]研究表明：6-BA促进分化而不利于成苗，添加KT、ZT促进成苗而不利于分化。本文通过实验证明：选择6-BA、NAA、KT、ZT多激素搭配和最适合的浓度配比，不仅愈伤绿色凸起增多、分化繁盛 ，而且苗油绿，茎秆粗，丛生芽、丛生苗增多，新愈伤长出。实验得出：利用生长素和几种细胞分裂素进行最适合的比例配合使用，用来作为紧穗野生稻幼胚分化改良培养基，成功将幼胚愈伤分化出健壮油绿的再生苗和丛生苗，并使分化率得到大幅提高。不同的品种材料在选择基本培养基及激素搭配和比例配比时，必须对症下药，方可见效，以免适得其反。

3.4 激素对紧穗野生稻幼胚生根苗产生的影响

众所周知，作为生长素的NAA和IAA，其主要作用是诱导愈伤组织的形成、胚状体的产生以及试管苗的生根，本实验对NAA和IAA各设置了9组梯度浓度比较，实验结果得出：以IAA 0.3 mg/L对根芽启动效果最好，对促进主根根粗、主根生长、须根出根率、须根长具有显著效果。

3.5 炼苗与栽种及田间管理

实验结果表明：生根苗从揭膜、定植、炼苗到栽种，经历39 d，由组培苗过渡到自然生长苗，从无菌状态变成有菌状态，这样一个循序渐进的过程，苗的田间成活率达到98%。苗在田间的生长过程中，注意水、肥管理及病虫害防治，后期追施一次肥，直至种子成熟。在本研究中，通过对紧穗野生稻幼胚愈伤诱导培养，筛选出最适合的N6基本培养基，选择最适宜的激素组合，根据不同生长时期的要求来确定激素配比和培养基配方，成功地建立起一套高效高质量的紧穗野生稻幼胚愈伤诱导、分化、生根培养基的再生体系，并将改良后的培养基在实践中得到充分应用，取得较好效果；突破了野生稻离体保存的关键技术，为野生稻的培育奠定了扎实基础。