王定锋，李良德，李慧玲，张 辉，王庆森，吴光远

(福建省农业科学院茶叶研究所，福建 福安 355015)

茶大灰象甲(即柑橘灰象甲)Sympiezomiascitri属鞘翅目Coleoptera象甲科Curculionidae，是一种杂食性且为害大的农业害虫，常给茶树、柑橘和油茶等多种经济作物生产造成严重的损失[1-2]。目前，在茶园和柑橘园中主要还是用化学防治方法来防控茶大灰象甲[3-7]，但化学农药的长期大量使用所引起的农业“3R”(残留、抗性、再度猖獗)问题，严重影响生态环境和人类健康，正日益受到人们的关注。因此，有必要寻找绿色、高效的防治手段(如昆虫病原真菌、病毒和寄生蜂等)来控制茶大灰象甲的发生危害。

棒束孢是一类重要的昆虫病原真菌，可侵染多种农林害虫，该属包含环链棒束孢Isariacateinannulata、细脚棒束孢I.Tenuipes、粉棒束孢I.cicadae和玫烟色棒束孢I.fumosorosea等多个种[8-9]。据Faria等报道，自上世纪60年代以来，有11种以棒束孢属真菌为主要成份的真菌杀虫制剂被开发、登记[10]。尽管棒束孢属真菌具有巨大的生防潜力，但在其分类问题上却存在较大的争议。按照传统的形态学鉴定结果棒束孢长期被划分到拟青霉属中[11]。而Luangsa-ard等应用β-tubulin序列和rDNA-ITS序列构建系统进化树，并结合部分形态学鉴定结果，重新将棒束孢列为一个属[8]。分子标记鉴定法能够快速、有效、精准的对不同真菌菌株进行鉴定，受到了研究者的青睐。核糖体rRNA序列、EF1-α序列和ITS序列等分子标记基因被广泛应用于昆虫病原真菌的鉴定，并取得了较好的鉴定效果[12-16]。鉴于分子标记鉴定法在昆虫病原真菌鉴定中的强大优势，本研究通过对棒束孢If410的rDNA-ITS，EF1-α和β-tubulin等3个分子标记基因的扩增、测序和系统发育树构建，明确了寄生茶大灰象甲的棒束孢If410为玫烟色棒束孢。本研究结果将为今后更好地利用该菌防治茶大灰象甲及其它鞘翅目害虫奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试菌株：棒束孢If410菌株分离自自然羅病死亡的茶大灰象甲成虫，并用萨氏培养基Sabouraud dextrose agar plus 1% yeast extract(SDAY)试管斜面保存于4℃冰箱中。

1.2 培养基

萨氏培养基(SDAY)：4%葡萄糖、1%酵母、1%蛋白胨、2%琼脂，pH 7.0。高压灭菌锅121℃灭菌20 min。

SDY培养基为SDAY的液体形式，除了不添加琼脂，其他成份、比例和灭菌条件同SDAY培养基。

1.3 棒束孢基因组DNA提取

把棒束孢孢悬液(1.0×106孢子·mL-1)接种到装有10 mL SDY培养基的三角瓶(30 mL)中，用摇床25℃，150 r·min-1，振荡培养4 d后刮取三角瓶内壁的菌丝体。棒束孢菌丝的基因组DNA提取，直接参照Raeder和Broda方法[17]。基因组DNA提取后，用岛津紫外分光光度计检测DNA质量和浓度，并直接用于后续试验。

1.4 菌株分子生物学鉴定

采用真菌通用引物ITS5 /ITS4[18]PCR扩增菌株rDNA-ITS序列。PCR反应参数为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s；70℃延伸30 s，共30个循环；70℃延伸5 min。采用引物983F/1567R扩增菌株translation elongation factor 1 alpha(EF1-α)序列[19]。PCR反应参数参考Rehner和Buckley的方法[16]：94℃变性2 min，66℃退火1 min，70℃延伸1 min；接着9个循环，每个循环的退火温度降低1℃；然后在36个循环，94℃变性30 s；56℃退火30 s；70℃延伸1 min；最后70℃延伸10 min。采用bt2a/bt2b[20]PCR扩增菌株β-tubulin序列。PCR反应参数为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，58℃退火30 s；72℃延伸2 min，共35个循环；72℃延伸8 min。扩增rDNA-ITS序列、EF1-α序列和β-tubulin序列的3对引物序列详见表1。3个序列的PCR反应体系都为25 μL，即2×TaqMix 10 μL，棒束孢If410基因组DNA 1 μL，上下游引物(10 mmoL)各1 μL，ddH2O补充至25 μL。rDNA-ITS序列和β-tubulin序列PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，回收纯化，直接送铂尚生物技术(上海)有限公司测序。而EF1-α序列经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，先连接到T载体上，转化到大肠杆菌DH5α中，再送铂尚生物技术(上海)有限公司测序。分别将rDNA-ITS序列、EF1-α序列和β-tubulin序列测序结果通过NCBI中Blast程序与在GenBank中的基因序列进行同源性分析。下载常见近缘种的相应序列，分别用MEGA4.0软件ClustalX方法进行多序列比对，并以NJ法(neigbor-joining method)分别构建分子系统发育树，用Bootstrap对系统树进行检验，重复1000次[21]。

表1 菌株检测的标识序列引物Table 1 Primers for sequencing to identify test strains

2 结果与分析

2.1 3个标记基因的扩增结果

以ITS5/ITS4、983F/1567R和bt2a/bt2b 3对引物分别从棒束孢If410基因组DNA中扩增出1条约600 bp的ITS片段、500 bp的EF1-α片段和大于300 bp的β-tubulin片段(图1)。PCR产物测序结果表明，ITS序列长度为589 bp，EF1-α序列长度为510 bp，菌株β-tubulin序列长度为330 bp。

图1 棒束孢If410 3个分子标记片段的琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products amplified from 3 molecular marker regions in If410注：1：EF1-α片段；2：ITS片段；3：DNA分子量标准；4：β-tubulin片段

2.2 棒束孢If410的分子鉴定

通过Blast与GenBank中已有的基因序列进行比对，结果表明，与棒束孢If410的rDNA-ITS序列相似性达98%以上的大部分序列都是玫烟色棒束孢I.fumosorosea。为进一步明确菌株If410与几种常见棒束孢的亲缘关系，分别选择GenBank中已公布的爪哇棒束孢I.javanica、虫草棒束孢I.farinosa、玫烟色棒束孢I.fumosorosea、高雄山虫草Cordyceps takaomontana、细脚棒束孢I.tenuipes、粉棒束孢I.cicadae、环链棒束孢I.cateniannulata等的rDNA-ITS序列进行系统发育树构建，结果表明，棒束孢If410菌株的rDNA-ITS序列与玫烟色棒束孢I.fumosorosea聚集在一个最小的进化分支上(Bootstrap值为97%)，并与其它棒束孢进化距离较远(图2)。在GenBank中与If410菌株的EF1-α序列相似性达98%以上的大部分序列都是玫烟色棒束孢I.fumosorosea。为进一步明确菌株If410与几种常见棒束孢的亲缘关系，分别选择GenBank中已公布的细脚棒束孢I.tenuipes、玫烟色棒束孢I.fumosorosea、环链棒束孢I.cateniannulata、爪哇棒束孢I.javanica、虫草棒束孢I.farinosa、高雄山虫草Cordyceps takaomontana、粉棒束孢I.cicadae等的EF1-α序列进行系统发育树构建，结果表明，棒束孢If410菌株的EF1-α序列与玫烟色棒束孢I.fumosorosea聚集在一个最小的分支上(Bootstrap值为100%)(图3)。在GenBank中与If410菌株的β-tubulin序列相似性达99%以上的大部分序列都是玫烟色棒束孢I.fumosorosea。为进一步明确If410菌株与几种常见棒束孢的亲缘关系，分别选择GenBank中已公布的细脚棒束孢I.tenuipes、粉棒束孢I.cicadae、玫烟色棒束孢I.fumosorosea、环链棒束孢I.cateniannulata、爪哇棒束孢I.javanica等的β-tubulin序列进行系统发育树构建，结果表明，If410菌株的β-tubulin序列与玫烟色棒束孢I.fumosorosea聚集在一个最小的分支上(Bootstrap值为96%)(图4)。综合3个标记基因构建的系统进化树结果，我们判定棒束孢If410菌株为玫烟色棒束孢I.fumosorosea。

图2 基于rDNA-ITS序列的If410菌株及棒束孢类群的系统发育树Fig.2 Phylogeny of rDNA-ITS gene sequences of If410 and Isaria注：末端标记为rDNA-ITS序列Genbank上的登录号+菌株拉丁文，下同。

3 结论与讨论

以往对昆虫病原真菌的鉴定都是依靠形态学鉴定为主，该方法耗时费力，而且鉴定的结果容易出现偏差。近年来，随着GenBank数据库中各种分子标记基因序列的日益丰富，使得利用分子标记来鉴定真菌、构建真菌系统发育树的研究越来越便利。本研究利用ITS5/ITS4、983F/1567R和bt2a/bt2b 3对引物分别从玫烟色棒束孢If410中扩增出ITS片段、EF1-α片段和β-tubulin片段，并对3个分子标记基因进行了测序和系统发育树的构建，最终确定了该菌株为玫烟色棒束孢。该鉴定结果表明ITS片段、EF1-α片段和β-tubulin片段3个分子标记基因可以有效的对棒束孢属内不同种进行有效鉴定。本研究结果与D’Alessandro等[22]报道的EF1-α和ITS序列是改善棒束孢属与其他昆虫病原真菌特征、鉴定和系统发育关系的有效工具较一致。

图 3 基于EF1-α序列的If410菌株及棒束孢类群的系统发育树Fig. 3 Phylogeny of EF1-α gene sequences of If410 and Isaria

图4 基于β-tubulin序列的If410菌株及棒束孢类群的系统发育树Fig.4 Phylogeny of β-tubulin gene sequences of If410 and Isaria

虽然有报道发现球孢白僵菌[23]和布氏白僵菌[24]对茶大灰象甲具有很高的杀虫毒力，但当前还未见玫烟色棒束孢寄生茶大灰象甲的相关报道。玫烟色棒束孢作为一种重要的昆虫病原真菌，可侵染桃蚜[25]、烟粉虱[26]和象鼻虫[27]等多种害虫。自上世纪60年代以来，有10种以玫烟色棒束孢为主要成份的微生物制剂产品被开发、登记[10]。而本研究新鉴定出的茶大灰象甲寄生真菌为玫烟色棒束孢，进一步丰富了茶大灰象甲杀虫真菌的资源库，为今后更好地利用玫烟色棒束孢防治茶大灰象甲及其它鞘翅目害虫奠定基础。