黄 宽，向润清，林艾和，张艳娇，范 源,2△

（1.云南中医药大学，云南 昆明 650500；2.云南中医药大学第二附属医院，云南 昆明 650216）

余甘子为大戟科叶下珠属植物余甘子Phyllanthus emblica L.的干燥成熟果实，是藏族习用药材。其性味甘、酸、涩、凉；归肺、胃经；具有清热凉血，消食健胃，生津止渴的功效；常用于治疗血热血瘀、咳嗽、喉痛、口干、消化不良、腹胀等[1]。余甘子中富含多酚鞣质类、黄酮类、有机酸、维生素、氨基酸等活性成分[2]，以多酚类鞣质含量最多[3]，具有抗菌[4-5]、抗炎[6]、抗病毒[7]、抗肿瘤[8-10]、抗氧化[11-15]、降血糖[16]等药理作用，研究发现没食子酸和其酯类衍生物可作为一种有价值的抗癌药物[17-18]。没食子酸（Gallica acid，GA）、焦性没食子酸 （Pyrogallic acid，PA）、1，3，6-O-三没食子酰基葡萄糖（1，3，6-tri-O-galloyl-β-D-glucose，TGG）、1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基葡萄糖 （1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-β-D-glucose，β-PGG）属天然水解类鞣质，没食子鞣质极不稳定，容易在酸、碱、酶的催化作用下水解，生成没食子酸和多元醇。GA为弱酸性物质，在高温或催化条件下还原脱羧后可生成焦性没食子酸。β-PGG在酸、碱条件下发生水解，逐步生成四没食子酰葡萄糖、TGG、二没食子酰葡萄糖、葡萄糖和没食子酸[19]。余甘子作为药食两用的传统习用民族药物，营养丰富，药效明确，目前其加工利用主要有果汁、果肉制成的饮料、果脯、果酒、果酱，其种子和提取物也常作为食品或添加剂使用[20]。但余甘子在我国的开发利用度还相对较低，为使其有效物质活性高，且不出现褐变反应，溶剂pH值尤为关键。本研究以提高余甘子质量标准为目的，以期获得有效控制余甘子质量的方法。

图1 化学结构

1 仪器与试剂

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司），色谱柱为 Agilent Zorbax C18键合硅胶柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；语路超声波清洗机（深圳市即洁超声科技有限公司）；DFY-600摇摆式高速万能粉碎机（永康式速锋工贸有限公司）；T-1000型电子天平（上海浦春计量仪器有限公司）；AB265-SMETTLER TOLEDO十万分之一分析天平（Mettler-tolido international trade（Shanghai）co.LTD）。

对照品：焦性没食子酸（PA批号：TS0905CA14，上海源叶生物科技有限公司）、没食子酸（GA批号：wkq16081904，四川省维克奇生物科技有限公司）、1，3，6-O-三没食子酰基葡萄糖（TGG 批号：CFN95043，武汉天植生物技术有限公司）、1，2，3，4，6-O-五没食子酰葡萄糖 （β-PGG 批号：PRF10011001，成都普瑞法科技开发有限公司）；余甘子（批号：P20180612，安国市旭芳中药材经营有限公司）。甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Zorbax C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～2 min，2%～5%A；3～10 min，5%～10%A；10～26 min，10% ～15%A；26～45 min，15% ～26%A；45～75 min，26%～35%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：25℃；进样量：10 μL。理论塔板数按焦性没食子酸计算应不低于3 000。色谱图见图2。

图2 高效液相色谱图

2.2 溶液的制备

2.2.1 磷酸缓冲液 A液：10 mL磷酸溶液，加水定容至100 mL；B液：7.2 g磷酸氢二钠加水定容至100 mL。分别取上述不同体积的A液和B液混合配制成不同 pH（2、3、4、5、6、7、8）的磷酸盐缓冲溶液，即得。

2.2.2 混合对照品溶液 分别精密称取各对照品适量，加甲醇定容。配制各对照品质量浓度分别为焦性没食子酸 0.229 mg/mL、没食子酸 0.148 mg/mL、1，3，6-O-三没食子酰基葡萄糖 0.018 mg/mL、1，2，3，4，6-O-五没食子酰葡萄糖 0.031 mg/mL。

2.2.3 供试品溶液 精密称取干燥的余甘子粉末2 g，精密加30 mL的70%甲醇，超声60 min，冷却后用甲醇补足减失质量，过滤，滤液浓缩后用甲醇定容至25 mL，备用。用移液枪分别移取1 mL置于6个样品瓶中，再分别加入 1 mL pH 为 2、3、4、5、6、7、8 的磷酸缓冲液，摇匀静置，即得不同pH条件下的供试品溶液。

2.2.4 空白样品溶液 因最终定容时所用的溶剂为甲醇，故本研究中以甲醇作为空白溶液。

2.3 线性关系考察 配制不同质量浓度的对照品溶液，在“2.1”项条件下依次连续进样，以质量浓度（mg/mL）为横坐标（X），峰面积（mAU*s）为纵坐标（Y）进行线性回归，绘制标准曲线，结果见表1，表明各成分均具有良好的线性关系。

表1 线性关系考察结果

2.4 精密度试验 精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液，在“2.1”项条件下连续进样6次，结果显示PA、GA、TGG、β-PGG峰面积RSD分别为0.72%、0.92%、1.15%、1.30%，表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验 取同一份供试品溶液，在“2.1”项条件下，分别于 2、4、6、8、10、12 h 进样，结果显示PA、GA、TGG、β-PGG 10 h内峰面积的 RSD 值分别为1.21%、1.24%、1.11%、1.65%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.6 重复性试验 取同一批余甘子粉末6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项条件下进样，结果显示PA、GA、TGG、β-PGG含有量RSD分别为1.71%、1.15%、1.77%、1.56%，表明该方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验 精密称取已知含量的同一批余甘子样品粉末9份，每份精密称取2 g，分别按照药材含有量的80%、100%、120%加入混合对照品，按“2.2.3”项下方法制备供试溶液，在“2.1”项条件下进样，结果见表2。

2.8 含量测定 取3份不同批次余甘子样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项下条件下进样，计算4种成分含有量，结果见表3。

表2 加样回收率试验（n=9）

表3 含量测定结果（mg/g）

2.9 不同pH条件下含量变化 在缓冲液pH值为2～5的区间，随着pH的增大，PA含量呈逐渐减少的趋势；pH值为5～6的区间，随着pH的增大，PA含量呈逐渐增加的趋势；pH值为6～8的区间，随着pH的增大，PA含量逐渐减少，且当pH值为2时，在所测pH值范围中含量达到最高。在缓冲液pH值为2～5的区间，随着pH的增大，GA含量逐渐增加；pH值为5～6的区间，随着pH的增大，GA含量急剧减少；pH值为6～8的区间，随着pH的增大，GA含量逐渐下降，且当pH值为5时，在所测pH值范围中含量达到最高。在缓冲液pH值为2～4的区间，随着pH的增大，TGG含量逐渐增加；pH值为4～8的区间，随着pH的增大，TGG含量逐渐减少；且当pH值为4时，在所测pH值范围中含量达到最高。在缓冲液pH值为2～3的区间，随着pH的增大，β-PGG含量逐渐增加；pH值为3～5的区间，随着pH的增大，PGG含量逐渐减少；pH值为5～8的区间，随着pH的增大，PGG含量缓慢增加随后逐渐减少，且当pH值为3时，在所测pH值范围中含量达到最高。结果见表4和图2。

表4 不同pH条件下余甘子中GA、PA、TGG、β-PGG的含量变化（mg/g）

图3 不同pH条件下余甘子中4种成分含量变化

3 讨论

云南省是主要的余甘子野生资源分布区[21]，余甘子作为一种多民族习用药材，具有广泛的药学应用价值。根据多酚鞣质类类化合物易分解的化学性质，本研究测定不同pH条件下余甘子中PA、GA、TGG和β-PGG的含量变化，4种成分的测定可以为丰富和完善余甘子的质控体系提供参考。结果表明在pH 2～8之间，PA含量随pH的增大而减小，原因可能是PA在碱性条件下分解，随着pH升高，其分解增加，在pH为6时，可能是因为GA分解产生的PA，PA含量稍有增加；GA含量随pH的增大而减少，在pH为5时含量最高，可能是由于β-PGG在酸性条件下水解，随着pH升高，GA含量减少；TGG含量随着pH增大含量增加，原因可能是β-PGG分解导致的含量增加，在pH为4时含量达到最高；β-PGG含量随着pH的增大而减小，可能是β-PGG自身水解的原因。

余甘子作为主产于云南的常用藏方三果汤其中的一味，具有潜在而大的价值。本实验对不同pH条件下余甘子中PA、GA、TGG及β-PGG含量变化进行了研究，可为余甘子相关成分的质控、提取加工以及养护提供一定的理论参考。