李志超，李丹丹，薛海鹏，徐展望△

（1.山东中医药大学第一临床医学院，山东 济南 250355；2.山东中医药大学附属医院脊柱骨科，山东 济南 250355）

腰椎间盘突出症（lumbar disc herniation，LDH），是指腰椎间盘发生退行性改变以后，在外力作用下，纤维环部分或全部破裂，单独或者连同髓核、软骨终板向外突出，刺激或压迫窦椎神经和神经根引起的以腰腿痛为主要症状的一种病变[1]。其病程长、易复发，严重影响患者的正常生活。在中医学中，将腰椎间盘突出症归于“腰痛”“腰腿痛”“痹症”等范畴，病因病机多为跌仆闪挫，气血瘀滞，或肾精虚损，筋骨失养，或寒湿内浸，阻遏经脉等[2]。

临床上杜仲和续断配伍常用于LDH的治疗，其中杜仲能够补肝肾、强筋骨；续断能够补肝肾、强筋骨、续折伤。现代研究表明杜仲中的有效成分具有保肝护肾、提高骨密度、抑制骨吸收、调节骨代谢、延缓衰老、抗疲劳等作用[3-4]。续断中的有效成分具有保护骨组织、保肝降脂、抗炎、镇痛等作用[5]。由此可见，杜仲-续断配伍治疗LDH的疗效确切。然而由于中药多成分、多靶点、相互协同作用的特点，使得中药治疗疾病的作用机制十分复杂。网络药理学利用多层次网络构建，从整体角度分析药物的药效物质基础及作用机制，这种整体性、系统性的特点与中药治疗的整体观念和辨证论治的原则不谋而合。本研究选择常用药杜仲-续断药对开展网络药理学研究，以期明确杜仲、续断有效成分及作用靶点，并进一步分析该药对治疗LDH的作用机制，为LDH治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1 杜仲、续断药对活性成分的获取与筛选 在中药系统药理学数据库与分析平台数据库（Traditional ChineseMedicineSystemsPharmacologyDatabase and Analysis Platform，TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcm-spsearch.php）中分别录入杜仲、续断进行检索，按口服生物利用度（OB）≥30%，类药性DL≥0.18条件筛选出有效成分。

1.2 杜仲、续断药对靶点的整理 通过TCMSP数据库导出杜仲-续断药对有效成分所对应的靶点，然后导入 Unitprot数据库（https：//www.unitprot.org/），进行基因的标准化处理。

1.3 LDH靶点的获取与预测 在GeneCards（https：//www.genecards.org/）数据库以及 OMIM（http：//www.omim.org/）数据库中，以“lumbar disc herniation”为关键词进行检索，将检索到的蛋白名称复制到Uniprot数据库中进行基因的标准化处理，得到疾病相关的靶点信息。

1.4 杜仲-续断活性成分网络构建与分析 将杜仲、续断的活性成分导入Cytoscape3.7.2软件，构建有效成分的靶点网络图，并进行网络拓扑分析。在网络中，节点代表化合物信息，边代表有效成分－靶点的相互作用。

1.5 蛋白（PPI）互作网络图的构建与分析 先将杜仲、续断的有效成分作用靶点进行去重，再与LDH靶点组建“成分-靶点”数据库，取两者交集，组成“成分-靶点”映射文件，即寻找成分与疾病共有的靶点，将共有靶点与化合物成分输入STRING数据库，构建“杜仲、续断-LDH靶点”的PPI网络图。利用Cytoscape3.7.2软件中的Network Analyzer进行分析，根据节点度（degree≥9）值进行筛选，得到杜仲-续断治疗LDH的核心作用靶点。

1.6 生物通路及富集分析 将1.5筛选出的PPI网络核心靶标导入 DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）数据库中，进行KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路分析以及 GO（Gene Ontology）生物过程的富集分析。以P≤0.05，FDR≤0.05为筛选标准，筛选出符合条件的前20条GO生物过程与23条KEGG通路，并用表格的形式展示。通过通路富集结果对杜仲-续断治疗LDH的作用机制进行预测。

2 结果与分析

2.1 杜仲-续断药对有效成分的靶点筛选及预测利用TCMSP数据库，分别将杜仲、续断输入到数据库，进行成分搜索，将得到的成分按照口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18为条件进行筛选，得到有效成分共36个，其中杜仲有效成分28个，续断有效成分8个（见表1）。

2.2 杜仲-续断成分靶点的预测及成分-靶点网络图的构建 利用TCMSP网络数据库，将杜仲-续断药对的36个有效成分进行检索，获取其有效成分相对应的靶点，共1 785个。并将其导入Unitprot数据库进行基因名标准化处理，再通过Cytoscape3.7.2软件构建“杜仲-续断有效成分-靶点”网络图，见图1。

表1 杜仲-续断有效成分

图1 杜仲-续断有效成分靶点-网络图

网络图中共有168节点组成，“V字形”代表中药杜仲和续断，“蓝色椭圆形”代表杜仲-续断中有效成分共36节点，“红色椭圆形”代表有效成分所对应的靶点共132节点，节点与节点之间的边表示药物成分与靶点之间的相互作用关系，最大自由度104，最小自由度为1，平均自由度为8.84，其中度值排名前五的为β-谷甾醇、槲皮素、Cinchonan-9-al，6＇-methoxy-，（9R）-、山柰酚、（-）-Tabernemontanine，节点的自由度值分别为 104、88、56、56、52，说明这些化合物是杜仲-续断治疗腰椎间盘突出症的主要活性成分。

2.3 LDH相关靶点蛋白相互作用网络构建 通过GeneCards数据库筛选的与LDH相关的靶点有366个。将这些基因导Cytoscape3.7.2软件，构建“疾病-靶点”网络图（见图2）。图中共有366节点组成，红色圆形为疾病“腰椎间盘突出症”，蓝色矩形为疾病对应的靶点。节点与节点之间的边表示疾病LDH与靶点蛋白之间的对应关系。

图2 LDH-疾病-靶点网络图

图3 杜仲-续断“成分-疾病”靶点PPI图

2.4 核心靶点的筛选 通过网络合并，获得杜仲-续断和LDH的共有靶点36个（见表2）。将这36个靶点导入STRING数据库建立杜仲-续断“成分-疾病”靶点蛋白互作PPI网络图（图3），共得到36个节点，382条边，平均节点度为21.2；再将该结果以TSV格式导出，再通过Cytoscape3.7.2软件对该网络进行拓扑分析，以degree值≥22为筛选标准，得到20个核心靶点，环加氧酶（PTGS2）、基质金属蛋白酶3（MMP3）、白介素-1B（IL-1B）、C-C 基序趋化因子（2CCL2）、促分裂原活化蛋白激酶 8（MAPK8）、雌激素受体（ESR1）、血管内皮生长因子 A（VEGFA）、促分裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、肿瘤坏死因子（TNF）、干扰素 γ（IFNG）、基质金属蛋白酶 2（MMP2）、一氧化氮合酶（NOS3）、转录因子（JUN）、表皮细胞生长因子R（EGFR）、基质金属蛋白酶1（MMP1）、表皮细胞生长因子（EGF）、髓过氧化物酶（MPO）、促分裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、白介素-6（IL-6）、肿瘤抑制基因 p53（TP53），一起构成核心网络图，见图4。

表2 杜仲-续断-LDH共有靶点

图4“成分-疾病”核心靶点网络图

表3 杜仲-续断调控治疗LDH生物过程分析

2.5 GO生物过程结果分析 将2.4项得到的核心靶点录入David数据库并进行GO生物过程分析，得到分子功能、生物过程和细胞成分条目315个，以P≤0.05，FDR≤0.05为标准，筛选出符合条件的前20个GO条目（见表3）。主要包括一氧化氮生物合成过程的正调控（positive regulation of nitric oxide biosynthetic process）、细胞外间隙（extracellular space）、基因表达的正调控（positive regulation of gene expres－sion）、细胞外区（extracellular region）、脂多糖介导的信号通路（lipopolysaccharide-mediated signaling pathway）、血管生成（angiogenesis）、缺氧反应（response to hypoxia）等生物过程。

2.6 KEGG通路富集分析 将2.4项得到的核心靶点录入David数据库，得到KEGG通路80条，以P≤0.05，FDR≤0.05为标准，筛选出符合条件的23条信号通路（见表4），其中包括美洲锥虫病（Chagas disease）、HIF-1 信号通路（HIF-1 signaling pathway）、TNF信号通路（TNF signaling pathway）、类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis）、膀胱癌（Bladder cancer）、利什曼病（Leishmaniasis）等信号通路，其中，与LDH相关的通路可能为HIF-1信号通路、TNF信号通路。

3 讨论

表4 KEGG富集分析表

中医学中LDH多属于“腰痛”“腰腿痛”“痹症”等范畴。《中医病证诊断疗效标准》将LDH规范为血瘀证、寒湿证、湿热证和肝肾亏虚证四证。历代医家对腰痛病因病机的认识各有不同，对本病的辨证论治有不同的侧重，其中以补益肝肾为基本治法的方药使用较多。杜仲、续断二者味甘性温，归肝、肾经，皆能补肝肾、强筋骨，是临床治疗肝肾亏虚之腰椎间盘突出症的常用药对[6]。《玉楸药解》中记载：“杜仲，益肝肾，养筋骨，祛关节湿淫，治腰膝酸痛，腿足拘挛”；侯士良《中药八百种详解》中记载：“杜仲，甘温补肝肾，壮筋骨，为治腰痛必用之品”。《滇南本草》中记载：“续断，补肝，强筋骨。走经络，止经中疼痛”，《日华子本草》中记载：“续断，助气，调血脉，补五劳七伤。”杜仲-续断药对在历代医家的验方使用中十分常见，《千金要方》丹参丸，《扶寿精方》续断丸，《本事方》思仙续断丸等，均重视杜仲、续断两药配伍，效果显著。现代研究发现[7]，杜仲-续断配伍在补肾强骨中存在整体调节和综合治疗的优势，具有良好的临床疗效。

通过TCMSP数据库分析得出，β-谷甾醇、槲皮素和山柰酚可能是杜仲-续断药对治疗LDH的关键成分。β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化和调节人体甾体激素等多种生理作用[8]。β-谷甾醇可以通过减少NO的合成，抑制巨噬细胞IL-6活性，减少IL-1、TNF等炎性因子的分泌，起到抗炎的作用[9]。有研究证实，β-谷甾醇可显著降低细胞内脂质过氧化物含量、提高谷胱甘肽水平，减轻脂质蓄积造成的肝细胞的过氧化损伤，从而起到保护肝脏的作用[10]。槲皮素具有抗炎、抗病毒、抗氧化、免疫抑制等广泛的药理作用[11]。胡庆华等[12]研究表明，槲皮素可明显缓解高果糖饮食或氧嗪酸钾盐诱导的高尿酸血症，并可通过下调NLRP3炎症体各组分和TLRs信号通路中关键分子基因和蛋白水平，缓解肾脏炎症反应及减轻肾损伤，起到改善肾功能的作用。袁小亮等[13]研究表明，槲皮素可显著降低MMP-13/TIMP-1的比例，促进抑制软骨细胞外基质的降解，促进对关节软骨的保护。山奈酚具有抗炎、抗氧化、抗菌等药理作用[14]。研究表明山柰酚可显著降低IL-1B等因子的表达，抑制大鼠OA软骨细胞促炎介质的表达[15]。汤利华等[16]的实验研究表明，在糖尿病肾病大鼠中，山奈酚能够降低大鼠蛋白尿、血肌酐和尿素氮含量，同时降低Caspase-3、Caspase-9、NLRP3、ASC和Caspase-1及炎症因子IL-18和IL-1B的表达水平，对肾功能和组织病理损伤具有保护作用。故杜仲-续断药对中的β-谷甾醇、槲皮素和山柰酚等有效成分，表现出抗炎、保护肝脏、改善肾功能、保护软骨等显著功效，很可能是治疗LDH的有效成分。

杜仲-续断治疗LDH的多个有效成分对应多个靶点，通过对“药物-疾病”核心靶点网络图分析，结果显示 PTGS2、MMP3、TNF、IL-6、IL-1B 等 20 个核心靶点在杜仲-续断治疗LDH中发挥了重要作用。目前，现代医学一致认为椎间盘退变是LDH最本质的病理变化之一，不仅表现有形态学和组织学的变化，同时也伴随生化性质的一系列改变。其中，IL-6、IL-1B、TNF和MMP3都是重要的细胞因子，是可能导致椎间盘退变的原因之一[17]。MMP3是细胞外基质降解的重要蛋白之一，能够改变椎间盘基质内蛋白多糖、胶原、弹性蛋白等生物大分子的结构、功能及含量，从而在椎间盘退变和突出中起作用[18-19]。IL-6可刺激炎症细胞聚集、促进炎症介质合成，诱导MMPS的表达，破坏蛋白聚糖II型胶原的比例，使髓核脱水，加速椎间盘退变[20]。TNF内的多种生物学活性可以促进细胞因子和炎症介质的生成，改变内皮细胞的通透性，参与痛觉敏感性的形成；诱导MMPS活性上调，减少胶原和蛋白多糖的合成[21-22]。在一项骨关节炎的研究中发现，槲皮素能减少IL-1B、TNF、IL-6等细胞因子的表达，抑制软骨细胞外基质的降解，保护关节软骨[23]。PTGS2可参与炎症、凋亡和免疫反应，细胞因子和趋化因子的级联反应，调控破骨细胞与成骨细胞的生成和分化[24-25]。由此可见，杜仲-续断可能通过作用于以上 IL-6、IL-1B、MMP3、TNF 和 PTGS2 等靶点，参与治疗LDH的消炎镇痛、抑制椎间盘的退变等过程。

通过KEGG通路富集分析，HIF-1信号通路、TNF信号通路等可能是治疗LDH的关键通路。张丹等[26]认为，HIF-1在成血管-成骨耦连反应中发挥关键作用，作为上游基因调控着体内多种成血管、成骨基因的表达，促进血管形成的同时，协同促进骨的再生。TNF信号通路中的TNF-α不仅可以使其信号通路发生异常，还可以和其他促炎性细胞因子刺激破骨细胞分化和活化，而引起骨丢失，刺激滑膜成纤维细胞和软骨细胞产生降解软骨的蛋白酶，最终导致关节和软骨的破坏[27]。故杜仲－续断中的β-谷甾醇、槲皮素和山奈酚等很可能通过 IL-6、IL-1B、TNF、MMP3、PTGS2等靶点作用于HIF-1信号通路、TNF信号通路，参与各细胞因子的调控，抑制炎性因子表达，促进骨的生成，减少软骨和关节的破坏，从而发挥治疗LDH的作用。

综上所述，杜仲-续断在治疗LDH上具有多成分、多靶点、多通路的特点，因数据有限，存在一定的局限性，从整体层面分析药物与疾病间的作用机制，初步预测了杜仲-续断药对参与治疗LDH的核心靶标，为治疗LDH提供了一些新的思路，也为今后进一步的分子生物学验证提供了理论基础。