吕彤彤 ，鞠成国，2∗，刘博男，贾天柱，2

（1.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600；2.辽宁省中药炮制工程技术研究中心，辽宁 大连 116600）

仙茅为石蒜科植物仙茅Curculigo orchioidesGaertn.的干燥根茎［1］，始载于 《雷公炮炙论》，其性辛、温，味苦，有毒，归肝、肾经［2］，具有补肾助阳、益精血、强筋骨、行血消肿的功效。现代植物化学研究表明，仙茅成分比较复杂，主要包括酚及酚苷类、木脂素类、皂苷元及皂苷类、黄酮类、桉烷类、脂肪族类、生物碱类、甜味蛋白、多糖类、挥发油等［3-6］；现代药理研究显示，仙茅主要具有抗氧化、抗骨质疏松、增强免疫、补肾壮阳、抗炎、抗忧郁、抗老年痴呆等作用［7-12］，临床上多用于治疗骨质疏松症、乳腺增生、绝经后关节炎、更年期综合征及阳痿、再生障碍性贫血、原发性高血压等疾病；中医临床上常用其炮制品以增强补益作用，但2015 年版《中国药典》还未收载酒仙茅、盐仙茅等炮制品。

基于“入盐走肾脏”传统炮制理论，仙茅经盐炙后可引药下行入肾，明显增强其补肝肾强筋骨的作用。另外，酚苷类是仙茅补肝肾、强筋骨的物质基础，其中仙茅苷为苯甲酸酯酚苷类，是其补肝肾的有效成分之一，更是药典规定的指标性成分；苔黑酚葡萄糖苷为苔黑酚类酚苷，是仙茅强筋骨的有效成分之一，含有量最高［13-15］。目前对盐炙仙茅的研究较少，本实验拟结合UPLC 法，以仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷含有量为评价指标，采用正交试验对盐炙工艺进行优化，以期为该药材规范化、标准化、工业化生产奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 Waters H-Class UPLC 超高效液相色谱仪（包括四元高压梯度泵、自动进样器、柱温箱、蒸发光散射检测器、Empower2 数据处理工作站，美国Waters 公司）；电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；FA1004B 型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；DHG-9140A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；DFT-100 型高速万能粉碎机（浙江温岭市林大机械有限公司）。

1.2 试药 仙茅购自康美药业股份有限公司，经辽宁中医药大学中药鉴定室翟延君教授鉴定为石蒜科植物仙茅Curculigo orchioidesGaertn.的干燥根茎。仙茅苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号MUST-15062710，含有量99.17%）；苔黑酚葡萄糖苷对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批 号MUST-14041601，含 有 量98.81%）。食 盐（江苏金桥盐化集团古淮制盐有限公司，GB5461）；甲醇、磷酸、乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 盐炙品制备 取适量净仙茅段20 g 置适宜容器内，加入盐水（取0.4 g 盐，以不同盐水比例拌匀）闷润，待盐水被吸尽后置炒制容器内，不同温度下不断翻炒一段时间，取出，放凉，打粉，即得［16］。

2.2 仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷含有量测定

2.2.1 色谱条件 ACQUITY UHPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～4 min，3%A；4～5 min，5% A；5～5.5 min，7% A；5.5～6 min，10% A；6～8 min，11% A；8～8.5 min，12% A；8.5～9.5 min，13%A；9.5～10 min，13%A；10～13 min，15% A；13～15 min，15% A）；检测波长220 nm；体积流量0.3 mL／min；柱温30 ℃；进样量1 μL。理论板数按仙茅苷计算应不低于3 000。色谱图见图1。

图1 各成分UPLC 色谱图Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取仙茅苷对照品4.11 mg、苔黑酚葡萄糖苷对照品2.21 mg，置10 mL量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，稀释得到0.102 75、0.110 5 mg／mL 对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液制备 称取不同条件下盐炙品粉末（过3 号筛）约1 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，加热回流2 h，取出，放冷，称定质量，甲醇补足减失质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液20 mL，蒸干，残渣加甲醇溶解，移至10 mL 量瓶中，稀释至刻度，摇匀，过0.22 μm 微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.3 单因素试验

2.3.1 盐水比例 取饮片6 份，每份20 g，加入盐水（每100 kg 药材用食盐2 kg，比例1∶4、1∶5、1∶7、1：10、1∶15、1∶20）至密闭容器内，闷润3 h 后，于140～150 ℃下炒制5 min 后出锅，放凉，备用，结果见表1。由表可知，不同盐水比例下酚苷含有量有所差异，表明盐水比例是影响仙茅酚苷含有量变化的主要因素；盐水比例1∶7、1∶10、1∶15 时虽然含有量差异不足10%，在误差允许范围内，但在实际操作过程中1∶7 和1∶10 存在盐水与饮片无法完全拌匀的情况，所以结合实际，选择1∶15 进行正交试验。

2.3.2 炒制温度 取饮片6 份，每份20 g，加入盐水（每100 kg 药材用食盐2 kg，比例1∶7）至密闭容器内闷润3 h，分别在120～130、130～140、140～150、150～160、160～170、170～180 ℃下炒制5 min 后取出，晾凉，备用，结果见表2，采用120～130 ℃进行正交试验。

2.3.3 炒制时间 取饮片5 份，每份20 g，加入盐水（每100 kg 药材用食盐2 kg，比例1∶7）至密闭容器内闷润3 h，在140～150 ℃下分别炒制3、4、5、6、7 min 后取出，放凉，备用，结果见表3，可知炒制时间为5 min 时，综合评分最高，故选择其进行正交试验。

表2 炒制温度考察结果Tab.2 Results of frying temperature investigation

表3 炒制时间考察结果Tab.3 Results of frying time investigation

2.3.4 闷润时间 取饮片6 份，每份20 g，加入盐水（每100 kg 药材用食盐2 kg，比例1∶7）至密闭容器内分别闷润1、2、3、4、6、8 h，在140～150 ℃下分别炒制5 min 后取出，放凉，备用，结果见表4，可知闷润时间超过2 h 后酚苷含有量变化不大，表明闷润时间不是其主要因素。

表4 闷润时间考察结果Tab.4 Results of dull time investigation

2.4 正交试验 由上述单因素考察可以看出，影响盐炙仙茅酚苷成分的主要因素有盐水比例、炒制温度、炒制时间。以仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷含有量为评价指标，按L9（34）正交试验表进行优化。因素水平见表5，结果见表6，方差分析见表7。

表5 因素水平Tab.5 Factors and levels

表6 试验设计与结果Tab.6 Design and results of tests

表7 方差分析Tab.7 Analysis of variance

结果表明，盐水比例（A）和炒制时间（C）是影响仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷含有量的主要因素，各因素影响程度依次为炒制时间（C）＞盐水比例（A）＞炒制温度（B）。综合分析，确定最佳工艺为A2B1C2，即每100 kg 仙茅饮片用2 kg 食盐（食盐∶水=1∶15），闷润2 h，在110～120 ℃下炒制5 min。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 分别取仙茅苷对照品0.010 3、0.030 8、0.051 4、0.102 8、0.154 1、0.205 5 μg，苔黑酚葡萄糖苷对照品0.022 5、0.045 0、0.067 5、0.090 0、0.112 5、0.135 0 μg，在“2.2.1”项条件下进样测定。以进样量为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y）进行回归，得仙茅苷回归方程为Y=2×106X-4 094.7（r=0.999 3），在0.010 3～0.205 5 μg 范围内线性关系良好；苔黑酚葡萄糖苷回归方程为Y=4×106X+4 556.5（r=0.999 4），在0.022 5～0.135 0 μg 范围内线性关系良好。

2.5.2 精密度试验 精密称取盐炙品1 g，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项条件下进样测定6 次，每次1 μL，测得仙茅苷和苔黑酚葡萄糖苷峰面积RSD 分别为1.21% 和0.28%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 吸取同一份供试品溶液，在“2.2.1”项条件下于0、2、4、6、8、12、24 h 进样测定，每次1 μL，得仙茅苷和苔黑酚葡萄糖苷峰面积RSD 分别为0.76%和0.43%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5.4 重复性试验 取同一批盐炙品粉末6 份，每份1 g，精密称定，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项条件下各吸取1 μL 进样测定，测得仙茅苷和苔黑酚葡萄糖苷含有量RSD 分别为1.6% 和0.97%，表明该方法重复性良好。

2.5.5 加样回收率试验 精密称定仙茅苷和苔黑酚葡萄糖苷含有量已知的盐炙品粉末6 份，每份0.1 g，分别加入2 种对照品粉末0.15 mg 和0.59 mg，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项条件下进样测定，结果见表8。

表8 各成分加样回收率试验结果（n=6）Tab.8 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

2.6 验证试验 取3 批生品（每批100 g），按优化工艺制备3 份样品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项条件下进样测定，结果见表9，可知仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷平均含有量分别为0.10%和0.490 2%，综合评分99.2，表明工艺稳定可靠，合理可行。

表9 验证试验结果（n=3）Tab.9 Results of verification tests（n=3）

3 讨论

为了更准确地检出酚苷类成分，色谱柱考察了ACQUITY UHPLC BEH C18（2.1 mm ×50 mm，1.7 μm）和Ultimate UHPLC AQ-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），流动相考察了甲醇或乙腈与0.1%磷酸或甲酸的不同比例，检测波长考察了220、280 nm，最终确定为“2.2.1”项下条件。

酚苷类是仙茅补肝肾、强筋骨的物质基础［17］，故选用其中含有量较高的苔黑酚葡萄糖苷和药典指标成分仙茅苷作为评价指标，并进行加权求和（权重比例设为1∶1），优化仙茅盐炙工艺，具有一定的科学性与合理性。仙茅苷和苔黑酚葡萄糖苷作为仙茅酚苷类主要成分，含有量测定方法有薄层层析-紫外分光光度法、高效液相色谱法、紫外分光光度法等，本实验采用UPLC 法［18］，与HPLC法相比操作简便，结果准确，重复性好。