蒋云凤 孙宇

哺乳动物中枢神经系统的发育是一个贯穿始终的复杂过程。异常的神经发育可能会导致终身残疾甚至死亡[1-2]。在神经发生过程中，神经干细胞有可能产生三种细胞亚系，包括星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元[3-4]。神经元是一类由胞体、轴突和树突组成的双极性细胞，神经元轴突的发育过程包括极性的建立、轴突导向和轴突的延伸分支，这些发育过程对于神经元的发育以及脑建立神经环路至关重要[5]。轴突导向在发育过程中引导轴突生长[6]，并控制成年突触连接的结构可塑性。因此，进一步探究轴突导向的失调如何导致疾病发生，以及其分子机制，将有助于神经类疾病治疗策略的进一步发展。

核微小RNA（microRNA/miRNA）是一类长约18～23 核苷酸的非编码小RNA，对靶基因进行转录后水平及翻译水平调控，能特异性介导靶mRNA 降解或者抑制靶蛋白的翻译[7]。大量文献表明，miRNA参与多种生物学功能，如细胞分化、增殖、凋亡、迁移和转移，调控多种疾病。因此，实现miRNA 药物的安全靶治疗具有很大的价值和前景[8-9]。Mmu-miR-124是已知大脑中表达最丰富和最具特征的miRNA。相关研究表明，miR-124 通过靶基因参与神经发生和神经元分化过程[10-12]；miR-124/PTPN1 信号通路参与老年性痴呆的突触和记忆缺陷[13]；miR-124 也是中枢神经系统疾病（如神经胶质瘤、脑卒中等）有价值的诊断和预后指标[14-15]。因此，研究Mmu-miR-124 的靶基因及其在神经系统发育中轴突导向的相关信号通路具有很大的应用价值。

本研究通过生物学分析，预测Mmu-miR-124的靶基因，并对其靶基因集合进行Gene Ontology（GO）、Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes（KEGG）、Reactome Pathway 以及Protein-protein interaction（PPI）神经网络分析，为寻找Mmu-miR-124在神经发育中靶基因的功能研究提供理论基础，并通过qRT-PCR 初步验证生物学分析的结果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

清洁级E14.5 C57 小鼠（共2 只）购买自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，实验动物生产许可为SCXK（沪）2018-0006。本实验符合实验动物伦理操作规范，上海交通大学附属第九人民医院实验动物使用许可为SYXK（沪）2016-0016。

1.1.2 主要试剂和器材

DMEM/F12 培养基、B27 无血清补充剂、N_2 supplement、bFGF、EGF、多聚赖氨酸P6407-5MG、0.25%胰酶、Trizol（Invitrogen，美国）；Prime-Script RT 试剂（Takara 公司，）。

超净工作台、细胞培养箱（Thermo Fisher，美国），多功能酶标仪（Bio Tek，美国），倒置相差显微镜（Nikon，日本），实时荧光定量PCR 仪QuantStudio（ABI，美国）。

1.2 生物信息分析

1.2.1 Mmu-miR-124 的碱基序列

运用UCSC 基因组在线浏览工具（http://genome.ucsc.edu/）分析Mmu-miR-124 在基因组中的位置及保守性。运用mirbase（http://mirbase.org/index.shtml）查询Mmu-miR-124 的碱基序列。

1.2.2 预测可能的靶点基因

目标基因的选择对于表征miRNA 的功能至关重要。本研究使用StarBase（http://starbase.sysu.edu.cn）数据库预测Mmu-miR-124 的靶基因，选择mi-Randa（http://www.microrna.org/）、TargetScan（http://www.targetscan.org/）、microT、miRmap、PITA、RNA22、PicTar 中至少4 个软件重合预测的基因，纳入最后的统计。

1.2.3 基因本体论和通路富集分析

基于至少3 个数据库获得靶点基因后，通过DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）在线工具进行GO分析，识别靶点基因的功能类别，包括生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞成分（CC）。同时，进行KEGG pathway 富集分析，分析这些靶基因可能富集的信号通路。

1.2.4 整合蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络构建

交互基因检索工具（STRING）数据库是一种在线的蛋白质交互（PPI）信息评价工具。为了评估靶点基因之间的交互关系，点基因被上传到STRING（版本10.5；http://www.string-db.org/），然后利用Cytoscape 软件构建PPI 调控网络。通过其插件MCODE 对蛋白网络进行分析，根据蛋白之间相互作用程度（Degree）筛选出最有意义的30 个枢纽基因（hub gene）。此外，通过与KEGG 通路中的轴突导向通路的主要基因进行重合，以获得关键基因。

1.3 实时荧光定量PCR 分析

1.3.1 神经干细胞的培养

将E14.5 C57 小鼠胎鼠脑组织取出，加入0.25%胰酶，在培养箱中消化18 min。加入10 mL 含10%FBS 的接种培养基终止消化。过尼龙网去除组织碎片。将上清置于离心机中，1 500 r/min 转速离心5 min，弃上清，用含有1%N2 的DMEM/F12 重悬。将细胞以0.1×106cells/mL 的密度接种于多聚赖氨酸（Poly-D-lysine，PDL）（50 μg/mL）包被的培养板中，每2～3 天加液一次。神经干细胞分化培养基中含有20 ng/mL 的bFGF、EGF 和2%B27。置于37 ℃培养箱中培养，培养过程中使用倒置相差显微镜观察神经干细胞的生长情况。

1.3.2 qRT-PCR

按照说明书分别于第3、5、7、10 天提取神经干细胞的总RNA。逆转录使用Prime-Script RT 试剂逆转录重组特定的cDNA；反转录条件：37 ℃15 min，85 ℃5 sec。每个目标基因的表达水平检测使用一个标准的SYBR-Green 方法，以cDNA 为模板，扩增条件：预变性95 ℃30 sec；变性95 ℃5 sec；退火60 ℃30 sec，延伸72 ℃30 sec，重复40 个循环。以GAPDH 为内参基因，使用2-ΔΔCt法计算目标基因的相对表达水平（表1）。

表1 荧光定量PCR 引物序列Table 1 Realtime-PCR primer sequences

2 结果

2.1 Mmu-miR-124 的位置

首次在小鼠身上发现的成熟Mmu-miR-124，在小、大鼠和人类中完全同源。通过UCSC 基因组在线浏览工具得到Mmu-miR-124 在基因组中的位置（图1）。

图1 Mmu-miR-124 在基因组中所处的位置Fig.1 The location of Mmu-miR-124 in the genome

2.2 Mmu-miR-124 的靶基因预测

运用StarBase（http://starbase.sysu.edu.cn）数据库预测Mmu-miR-124 的靶基因，并选择miRanda（http://www.microrna.org/）、TargetScan（http://www.targetscan.org/）、microT、miRmap、PITA、RNA22、PicTar中至少4 个软件重合预测的基因，最终共纳入775个基因进入统计。

2.2.1 Mmu-miR-124 靶基因的GO 分析

将数据库预测的775 个靶基因上传至DAVID网站进行GO 功能分析，并列举出生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞成分（CC）的前5 个重要通路。GO 结果表明，Mmu-miR-124 靶基因在生物功能方面主要与内吞作用、翻译负调节和细胞形状调节有关；在分子功能方面主要与磷脂酰肌醇绑定、转录激活子活性、RNA 聚合酶II 核心启动子近端区序列特异性结合和mRNA 3'-UTR 绑定有关；在细胞成分方面主要与皱褶、核膜和刷毛缘有关（表2）。

2.2.2 Mmu-miR-124 靶基因的Reactome 通路分析

将数据库预测的775 个靶基因上传至Reactome pathway Database（https://www.reactome.org/），Reactome 通路分析，结果显示：靶点基因通路主要富集于RNA 聚合酶iii 转录终止、FGFR2 信号通路和IRS 介导的信号通路（图2）。

2.2.3 Mmu-miR-124 靶基因的KEGG 通路分析

将775 个靶基因上传至DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）网站行KEGG 分析，结果显示：通路主要富集于轴突导向、长时程压抑和鞘脂类代谢（表3）。

2.2.4 Mmu-miR-124 靶基因蛋白间的相互作用预测

通过字符串将预测的靶点基因上传至网络进行PPI 分析，并筛选出前30 个枢纽基因与KEGG 通路中的轴突导向通路的主要基因进行重合并得到关键基因：GSK3B、NRAS 和ITGB1。

2.3 荧光定量实时PCR 结果

在神经干细胞的培养过程中，倒置显微镜观察神经干细胞的生长，分别于第3、5、7、10 天提取神经干细胞的RNA，通过qRT-PCR 检测发现，ITGB1 不存在，随时间延长，Mmu-miR-124 表达增加，GSK3B表达略下降，NRAS 表达不变。Mmu-miR-124 与GSK3B 的碱基互补配对序列的配对预测提示了两者之间可能存在紧密的联系（图3、4）。

表2 生物过程、分子功能和细胞成分的前5 个重要的GO 通路Table 2 Top 5 significant GO terms of BP,MF and CC

图2 靶点基因的Reactome 通路Fig.2 Reactome pathway of target genes

表3 前10 个关键的KEGG 通路Table 3 Top 10 significant Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathways

图3 在神经发育中mmu-miR-124 及其靶基因的表达变化Fig.3 Changes in the relative expression of mmu-miR-124 and its target genes during the neurodevelopment

图4 Mmu-miR-124 与GSK3B 的碱基配对预测Fig.4 Prediction of base pairing between mmu-miR-124 and GSK3B

3 讨论

Mmu-miR-124 是大脑中表达丰富和功能强大的特异性microRNA，其通过多种机制参与神经系统疾病的发生，也是神经系统疾病诊断和治疗的重要指标之一[14，16－17]。本研究通过预测Mmu-miR-124 的靶基因，并通过生物信息学的手段对其靶基因进行KEGG 通路分析，得到前10 个关键的KEGG 通路，其中，前两个是与神经发育相关的通路：Axon guidance 和Long-term depression 通路，并将Axon guidance 通路中的14 个关键基因与PPI 蛋白网络的前30 个Hub 基因取交集得到重合的3 个关键基因，并对关键基因进行初步的qRT-PCR 验证。

许多神经疾病的特征是神经元连接的结构改变，从一开始的突触变化到整个轴突束的丢失以及重新连接。这种扰乱连接结构过程的分子机制尚不明确，然而，最新的研究结果表明，轴突导向蛋白在连接结构紊乱中发挥了重要的作用[6，18－19]。轴突导向蛋白在神经发育过程中引导轴突生长，并控制着成熟的突触连接以及结构的可塑性。研究证明，MmumiR-124 参与神经发育的多个过程。本研究通过对Mmu-miR-124 的靶基因进行生物信息学分析发现，其可能在轴突导向通路中起到关键的作用。通过生物信息学预测，并对所得的关键基因进行qRT-PCR初步验证，我们认为Mmu-miR-124 可能通过丝氨酸/苏氨酸激酶糖原合酶激酶-3（GSK3B）调控神经发育。研究表明，GSK3B 是多种细胞通路的主调控因子，包括胰岛素信号和糖原合成、神经营养因子信号、Wnt 信号、神经递质信号和微管动力学[20]。同时，GSK3B 与多种人类疾病有关，包括老年痴呆症、双相情感障碍、非胰岛素依赖型糖尿病、心脏肥大和癌症[21-23]。因此，Mmu-miR-124 很可能通过对靶基因GSK3B 的调控影响神经发育。

最近的研究证实，Mmu-miR-124 在神经系统以及肿瘤疾病中具有重要的生物学功能[13，16－17]，对Mmu-miR-124 靶基因功能的认识还有待进一步的探索和研究。本研究采用靶基因预测数据库得到可信度较高的靶基因集合，并对靶基因进行GO 功能注释和KEGG 信号转导通路富集分析，有助于对Mmu-miR-124 所参与的生物学过程有一个较全面的认识，为进一步深入研究其功能奠定了基础。但由于预测靶基因过程中不可避免地存在假阳性率，所以对预测得到的靶基因及其发挥的生物学功能需要进行进一步的实验验证。