洪国君，鄢海燕，邹纯才

(皖南医学院 药学院，安徽 芜湖 241002)

瓜蒌为葫芦科植物栝楼(TrichosantheskirilowiiMaxim.)或双边栝楼(TrichosanthesrosthorniiHarms.)的成熟果实，主要用于胸痹心痛等症[1]。其所含的皂苷类成分具有宁心安神、益气通脉、抗肿瘤、生津止渴、免疫调节等功效[2-4]。但对瓜蒌中皂苷的提取工艺优化未见相关文献报道。为此，本实验采用Box-Behnken响应面优化瓜蒌中皂苷的提取工艺。

1 仪器与材料

1.1 仪器 UV2550型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)；KQ250DE超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；AUW-220D型电子天平(日本岛津公司)；GKC数显控温水浴锅(上海波络实验设备有限公司)；eidolph-LR4010/4011jf旋转蒸发仪(德国海道尔夫公司)。

1.2 材料 瓜蒌皮(河北安国市御颜坊中药材有限公司，批号：201612)；瓜蒌子(河北安国市御颜坊中药材有限公司，批号：201612)；香兰素(香草醛)(国药集团化学试剂有限公司，批号：20140821，纯度≥99.5%)；齐墩果酸( 国药集团化学试剂有限公司，批号：20150911，纯度≥99.5%)；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 瓜蒌中总皂苷的提取 等量称取已烘干(在40℃烘箱中放置24 h)瓜蒌皮和瓜蒌子[2](5∶5， g/g)，在超声波清洗机(200 W,40 kHz)中超声提取之后进行抽滤，合并抽滤液，再用旋蒸仪将滤液浓缩至黏稠状,用60%乙醇定容至100 mL,再取其1 mL定容至10 mL。

2.1.2 含量测定方法 将“2.1.1”中溶液静置1 h后，取0.3 mL样品溶液，加入5%香草醛-冰乙酸0.1 mL，高氯酸0.6 mL，置60℃恒温水浴中加热10 min，取出再放入冰水浴中冷却15 min，然后加入5 mL冰乙酸后，摇匀，静置20 min，最后用UV在551 nm处测吸光度值[5]，观察其化学成分含量变化。

2.1.3 标准曲线的建立 将齐墩果酸对照品用15%甲醇定容，分别配置成浓度梯度为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5倍的溶液，测其吸光度，并以齐墩果酸浓度(g/L)为横坐标x,吸光度值(A)为纵坐标y，计算得出标准曲线回归方程 y=8.1442x-0.1377，r=0.9993。

2.1.4 方法学验证 精密度、稳定性、重复性和加样回收率的RSD值最大分别为3.15%、1.77%、2.76%、3.31%，RSD均小于5%，表明测定方法可靠。

2.2 单因素考察实验 单因素考察主要考察乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度、提取次数，在通过前期预试验的基础上以及相关文献记载[6-7]，将乙醇浓度的考察条件定于40%、50%、60%、70%、80%；料液比(g/mL)考察条件定于1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16；提取时间考察条件定于20、30、40、50、60 min；提取温度考察条件定于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃；提取次数考察定于1、2、3、4、5次。在各项考察条件中选出一个最优条件作为后续的提取条件，并为最终的响应面优化条件提供依据。

2.2.1 乙醇浓度的单因素考察 取40℃干燥24 h的瓜蒌(皮∶子=5∶5，g/g)，分别选用40%、50%、60%、70%、80%乙醇为提取溶剂，料液比为1∶12，提取温度为40℃，提取时间为40 min，提取次数为3次，合并滤液后回收溶剂得稠膏，用60%乙醇定容至100 mL，备用。按“2.1.2”中方法进行含量测定。

由图1可知，当乙醇浓度高于60%后吸光度增长有所下降，故暂定其合适提取乙醇浓度为60%。

2.2.2 料液比的单因素考察 取40℃干燥24 h的瓜蒌(皮∶子=5∶5，g/g)，在“2.2.1”的条件下，选用60%乙醇为提取溶剂，料液比分别为1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16，提取温度为40℃，提取时间为40 min，提取次数为3次，合并滤液后回收溶剂得稠膏，用60%乙醇定容至100 mL，备用。按“2.1.2”中方法进行含量测定。由图2可知，料液比在达到1∶12时吸光度值趋于平稳，故暂定1∶12为最佳料液比。

图1 不同乙醇浓度的吸光值

图2 不同料液比的吸光度值

2.2.3 提取时间的单因素考察 取40℃干燥24 h的瓜蒌(皮∶子=5∶5，g/g)，在“2.2.2”的条件下，选用60%乙醇为提取溶剂，料液比为1∶12，提取温度为40℃，提取时间分别为20、30、40、50、60 min，提取次数为3次，合并滤液后回收溶剂得稠膏，用60%乙醇定容至100 mL，备用。按“2.1.2”中方法进行含量测定。由图3可知，当提取时间高于40 min后，吸光度值基本趋于平缓，故可暂定最优提取时间为40 min。

图3 不同提取时间的吸光度值

2.2.4 提取温度的单因素考察 取40℃干燥24 h的瓜蒌(皮∶子=5∶5，g/g)，在“2.2.3”的条件下，选用60%乙醇为提取溶剂，料液比为1:12，提取时间为40 min，提取温度分别为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃，提取次数为3次，合并滤液后回收溶剂得稠膏，用60%乙醇定容至100 mL，备用。按“2.1.2”中方法进行含量测定。由图4可知，提取温度在高于30℃之后对提取的影响并不大，故选择剔除此条件。

图4 不同提取温度的吸光度值

2.2.5 提取次数的单因素考察 取40℃干燥24 h的瓜蒌(皮∶子=5∶5，g/g)，在“2.2.4”的条件下，选用60%乙醇为提取溶剂，料液比为1∶12，提取时间为40 min，提取温度40℃，提取次数分别为1、2、3、4、5、6次，合并滤液后回收溶剂得稠膏，用60%乙醇定容至100 mL，备用。按“2.1.2”中方法进行含量测定。由图5可知，提取次数超过3次基本对吸光度值大小影响很小，故可暂定最优提取次数为3次。根据上述结果可确定单因素考察的最优条件为乙醇浓度60%，料液比1∶12，提取时间30 min，提取次数3次。

图5 不同提取次数的吸光度值

2.3 响应面优化设计[3-4]将单因素中获得的最优条件作为0条件代码代入软件Design-expert，选择乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)、提取次数(D)为考察因素，按响应面优化L29(34),四因素三水平共得出29组实验，在完成试验后将实验数据代入，用响应面优化设计软件Design-Expert分析所得数据。

2.3.1 响应面优化设计实验 通过响应面优化软件设计，共需完成29组试验。

2.3.2 数据分析 通过响应面设计的试验，在“2.1.2”的方法下检测吸光度值，通过标准曲线[3]计算其含量，方差分析结果如表1所示。

由表1可知，模型的F=9.72，P<0.001，表明试验所采用的二次多项式回归方程模型是极显著的，有统计学意义[8]。失拟项P=0.0574(P>0.05)，无显著性差异，表明无失拟因素存在，能够较好地反映各因素与响应值间的实际关系。

表1 响应面二次多项式回归方程方差分析

来源平方和自由度均方FP模型0.11147.57×10-39.72<0.0001A0.0310.0338.26<0.0001B0.01510.01519.440.0006C0.01210.01214.90.0017D0.02810.02835.53<0.0001AB2.12×10-412.12×10-40.270.6103AC6.91×10-316.91×10-38.870.01AD1.29×10-411.29×10-40.170.6904BC3.61×10-413.61×10-40.460.5071BD8.56×10-518.56×10-50.110.7452CD4.41×10-614.41×10-65.66×10-30.9411A21.83×10-311.83×10-32.350.1474B23.86×10-313.86×10-34.960.0429C22.38×10-312.38×10-33.060.1023D20.01210.01214.820.0018残差0.011147.79×10-4失拟项0.01100.115.50.0574纯误差7.39×10-440.017总和0.12 28

2.3.3 瓜蒌提取物醇沉工艺优化结果及验证 根据“2.3.2”瓜蒌提取物醇沉工艺响应面分析结果，求得最佳条件为A(1) B(1) C(0) D(0)。即选择提取乙醇浓度为70%，料液比为1∶14，提取时间为30 min，提取次数为3次。

按照上述工艺条件选用5个不同批次瓜蒌样品进行验证试验，由验证结果可知，RSD为0.0759%，小于2%[9]，有较好的重复性和稳定性。

2.4 结果 瓜蒌中皂苷类有效成分在醇提法中的最佳条件为乙醇浓度70%，料液比1∶14(g/mL)，提取时间30 min，提取次数3次，测得皂苷含量为1.818 mg/g。

3 讨论

在测瓜蒌中皂苷的含量时要尽量保证在加入香草醛冰乙酸后静置时间相同，避免因人为误差导致的吸光度偏差。实验中在前期预试验的基础上，先进行了较大梯度的条件考察，然后再进行单因素考察，因此后期所得的数据结果彼此间会在较小的幅度下波动，从而导致显著性差异不够大，但是实际所得的优化条件结果较为准确。

在本实验中用单因素考察和Design-Expert软件进行响应面优化设计，从多个梯度的数据来进行考察，操作性较强，可信度较高，使瓜蒌的乙醇提取工艺得到有效的优化与改进，为今后进一步对瓜蒌中醇提物的研究铺下了基础，对瓜蒌类药物的深入研究有着较为重要的科研意义。