龙得雨，王艳珍，王永福，陈春环，吉万全，王亚娟

(西北农林科技大学农学院/农业部作物基因资源与种质创制陕西科学观测实验站，陕西杨凌 712100)

小麦是世界上广泛种植的粮食作物，全世界约有40%的人口以小麦为主要食粮[1]。由于小麦在基因组多倍化、驯化和育种过程中仅保留了其遗传多样性的一部分，遗传基础的逐步缩小使现代小麦品种极易受到病害侵袭[2]。小麦近缘种(包括野生和栽培)是小麦抗性基因的重要来源[3]，因此，开发和利用小麦的近缘种可有效地拓宽其遗传基础，增加其遗传多样性。卵穗山羊草(AegilopsgeniculateRoth)是一年生自花授粉异源四倍体植物，染色体构型为UgUgMgMg，其中染色体Ug组来源于小伞山羊草(Ae.umbellulataZhuk.)，Mg染色体组来源于丁芒山羊草(Ae.comosaSibth.et Sm.)，具有抗病、抗虫、耐盐、耐寒、耐热、早熟等特性，是小麦改良中重要的种质资源[4-5]。

小麦条锈病是由条锈菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的威胁全球小麦生产的一种毁灭性的真菌病害[6]，在中国曾多次大流行，特别是在中国西部麦区尤为严重[7]。目前，防治小麦条锈病的途径主要有种植抗病品种和化学防治两种，种植抗病品种是防治条锈病最经济有效的措施[8]。白粉病(致病菌Blumeriagraminisf.sp.tritici)是中国小麦生产上的重要病害之一，该病频繁发生，危害严重，严重威胁着小麦生产安全[9]。由于小麦条锈病和白粉病分布广泛、生理小种复杂多变，常常导致品种抗性频繁丧失，引起病害流行[10]。因此，亟需开发新的抗病基因。利用小麦近缘种创制、筛选和鉴定出新的带有抗性基因的材料，可为进一步将抗性基因转移到小麦中奠定基础。

本课题组前期以中国春(CS)为母本、卵穗山羊草SY159为父本进行杂交，F1代与CS回交，再经过连续自交，得到BC1F8群体，并且筛选得到7M附加系和7M(7A)代换系。1003是从BC1F8群体中筛选出的、体细胞染色体数目为44条的衍生后代。本研究拟通过细胞学、原位杂交(GISH和FISH)和分子标记等技术，结合形态学以及白粉病和条锈病抗性调查，对小麦-卵穗山羊草衍生后代1003进行鉴定，以期明确该种质的染色体构型以及外源染色体的同源群关系，为其在小麦品种改良和抗病育种中的有效利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

植物材料包括普通小麦品种中国春(CS)、辉县红、陕优225、铭贤169，以及卵穗山羊草SY159、中国春-卵穗山羊草衍生后代1003、小麦-卵穗山羊草7M附加系[5]和小麦-卵穗山羊草7M(7A)代换系，均由西北农林科技大学农学院染色体工程实验室提供，并在西北农林科技大学北校区试验田严格套袋自交，收获种子。

白粉菌生理小种为E09，来源于西北农林科技大学农学院；条锈菌生理小种为条中29(CYR29)、条中23(CYR23)、条中31(CYR31)和条中32(CYR32)等，均由西北农林科技大学植保学院提供。

1.2 细胞学鉴定

参照朱 晨等[11]的方法对田间所取的根尖和幼穗分别进行不同的处理，并镜检。采用的荧光显微镜为Olympus BX-53(日本)，CCD 成像系统。采用Photoshop CS5软件处理图像。

1.3 原位杂交

在23 ℃黑暗培养箱中将种子置于培养皿中湿润的滤纸上培养2～3 d，待根长至2 cm左右时，取下根尖置于湿润的打孔离心管中，笑气(N2O)处理2～3 h，用90%的醋酸固定根尖5～10 min，ddH2O洗涤2～3遍后，加入70%的酒精，保存于-20 ℃备用。参照Han等[12]的方法制备根尖染色体中期的片子，利用相差显微镜镜检筛选出好的片子，保存于-20 ℃备用。参照十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)法提取卵穗山羊草SY159的基因组DNA[13]，通过切口移位(nick translation)法用荧光素Texas Red-dCTP标记探针，以CS的DNA为封阻，对1003进行基因组原位杂交(GISH)分析。参照Tang等[14]的方法，利用Tamra(6-carboxytetramethylrhodamine)修饰的寡核苷酸探针Oligo-pTa535(红色)和6-FAM(6-carboxyfluorescein)修饰的寡核苷酸探针Oligo-pSc119.2(绿色)进行荧光原位杂交(FISH)分析。参照Tang等[15]的方法，利用Tamra修饰的寡核苷酸探针Oligo-44(红色)对特定染色体进行非变性荧光原位杂交(Non-denaturing fluorescenceinsituhybridization,ND-FISH)分析。寡核苷酸探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。镜检采用Olympus BX-53荧光显微镜，使用CCD成像系统进行图像采集，并用Photoshop CS5软件处理。

1.4 分子标记

参照CTAB法提取供试材料的基因组DNA[13]，利用表达序列标签(expressed sequence tag,EST)和PLUG(PCR based landmark unique gene)引物分别进行扩增，比较卵穗山羊草SY159和1003是否存在与CS特异的扩增条带，进一步确定1003中外源染色体的同源群归属。PLUG引物来源于已公开发表的文章[16]，EST引物从网站(http://wheat.pw.usda.gov/SNP/new/pcr_primers.shtml)中选取，由北京奥科鼎盛生物技术有限公司合成。PCR扩增体系和反应程序均参照朱 晨等[11]的方法，扩增产物均采用8%非变性的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，用1%的硝酸银溶液染色后显影并拍照。

1.5 白粉病和条锈病抗性鉴定

苗期白粉病抗性鉴定在室内培养箱中进行，种植于穴盘中，每穴为边长4 cm的小室，每穴10粒，重复3次，感病对照陕优225在穴盘中随机种植。当材料长至两叶一心期时，通过自然传播和人工抖落的方式接种白粉菌生理小种E09。接种15 d后，待感病对照充分发病后，参照盛宝钦[17]划分的6级标准记载苗期白粉病的反应型，0、0；、1、2、3、4型分别表示免疫、近免疫、高抗、中抗、中感和高感。

苗期条锈病抗性鉴定在西北农林科技大学植物病理研究所温室中进行，鉴定方法参照相关文献[18-19]，将参鉴材料种植于8 cm×8 cm的花盘中，每份材料种10粒，待材料长至2叶期，将条锈菌与滑石粉按照1∶50的比例混合，抖粉法接菌，分别接种条锈菌生理小种CYR29、CYR23、CYR31和CYR32，以辉县红和铭贤169为感病对照。接种后15 d左右，待感病对照充分发病时按照0～4级标准[20]记载反应型，此后每3 d重复鉴定一次，连续鉴定3次。

1.6 农艺性状调查

试验材料于2017年10月上旬种植在西北农林科技大学农学院试验田，行长1.0 m，行间距 0.25 m，材料种植间距为5～10 cm；2018年成熟期每份材料随机选取10株调查株高、穗形、穗长、小穗数性状，收获后，对其千粒重、粒长和粒宽等性状进行调查，参考李立会等[21]的标准进行数据记录。

2 结果与分析

2.1 细胞学分析结果

对1003的根尖和穗子进行镜检，结果表明，根尖体细胞有丝分裂中期含有44条染色体(图1A)；花粉母细胞减数第一次分裂中期含有22对二价体(图1B)且配对良好；花粉母细胞减数第一次分裂后期含有44条染色体且均等分离(图1C)。这些结果表明1003在细胞学上已经高度稳定。

图1 1003在有丝分裂中期(A,2n=44)、减数分裂中期I(B,2n=22 II)和后期I(C,2n=44)的染色体特征Fig.1 Mitotic(A,2n=44),meiotic metaphase I(B,2n=22 II),and meiotic anaphase I (C,2n=44) chromosome characteristics of 1003

2.2 基因组原位杂交结果

以卵穗山羊草SY159的基因组DNA来标记探针，以CS的基因组DNA作为封阻，DAPI(蓝色)复染，进行GISH分析。结果(图2)表明，1003是携带42条小麦染色体和2条卵穗山羊草SY159染色体的二体附加系。

2.3 分子标记分析结果

为了确定外源染色体的同源群归属，利用本实验室现有的72对EST引物和135对PLUG引物进行分子标记分析，这些引物在7个同源群中均有分布。经过筛选，共得到1对EST引物和6对PLUG引物能在1003中扩增出与卵穗山羊草SY159相同的特异性条带，这些引物均属于第7同源群(表1)，表明1003中的外源染色体来源于第7同源群，为7M或7U。利用筛选出的这7个特异性分子标记比较CS、卵穗山羊草SY159、1003、7M附加系和7M(7A)代换系的差异，结果(图3)表明，1003与7M附加系和7M(7A)代换系中均存在与卵穗山羊草SY159相同的特异性条带，且带型一致，表明1003所携带的外源染色体为7M。

红色为卵穗山羊草基因组DNA探针。

The red is the genomic DNA probe ofAe.geniculataRoth.

图2 1003的根尖细胞基因组原位杂交(GISH)结果

Fig.2Genomicinsituhybridization(GISH)results in root tip cell of 1003

M：DL2000；1：中国春；2：卵穗山羊草SY159；3：1003；4：7M(7A)代换系；5：7M附加系；6：1003；A～F依次为PLUG引物TNAC1941、TNAC1888、TNAC1929、TNAC1868、TNAC1845、TNAC1782的扩增结果；G为EST引物BE637663扩增结果；F为HAEIII酶切;A～E为TaqI酶切；箭头所指为卵穗山羊草特异条带。

M:DL2000;1:Chinese Spring(CS);2:Ae.geniculataRoth SY159;3:1003;4: 7M(7A) substitution line;5:7M additional line;6:1003;A-F is the PLUG markers amplification results with TNAC1941, TNAC1888, TNAC1929,TNAC1868, TNAC1845, TNAC1782;G is the EST marker amplification results with BE637663;F is theHAEIII digestion;A-E is theTaqI digestion; The arrow refers to theAe.geniculataRoth SY159 specific band.

图3 EST和PLUG引物在1003、中国春、卵穗山羊草SY159、7M附加系和7M(7A)代换系中的扩增结果

Fig.3Amplification results with EST and PLUG markers in 1003,CS,Ae.geniculataRothSY159,7M addition line and 7M(7A) substitution line

2.4 荧光原位杂交分析结果

以寡核苷酸探针Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2对1003进行多次FISH分析(图4B)，与CS的标准核型[14]进行比较，可区分出38条与CS信号完全一致的染色体，2对FISH信号发生变异的小麦染色体，其中4A染色体顶端的绿色信号均丢失，另一对FISH信号变异的染色体推测为5A；一对两端具有Oligo-pTa535信号的外源染色体，且与7M附加系(图4C)和7M(7A)代换系(图4 D)中的7M染色体的FISH核型主体信号一致，但略有差异。结合分子标记的结果，可以确认1003中的外源染色体为7M。为了进一步确认FISH信号变异染色体是否为5A，利用寡核苷酸探针Oligo-44对1003进行多次ND-FISH分析(图5A)，与Tang等[15]的特定染色体的标准核型相比较，并在同一个根尖细胞中利用寡核苷酸探针Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2对Oligo-44的结果进一步验证(图5B)，结果表明，这对FISH信号变异的染色体为5A。

表1 1003与卵穗山羊草SY159中具有特异条带的EST和PLUG标记Table 1 EST and PLUG markers with specific bands in 1003 and Ae.geniculate Roth SY159

2.5 白粉病和条锈病抗病性鉴定结果

室内苗期接种白粉菌生理小种E09进行白粉病抗性鉴定，结果(图6)表明，CS和感病对照陕优225的反应型为4级，表现为高感；卵穗山羊草SY159的反应型为0级，表现为免疫；1003、7M附加系和7M(7A)代换系的反应型均为0级，表现为免疫。结果表明1003携带有抗白粉病生理小种E09的基因，且来源于卵穗山羊草的7M染色体。

温室内分别接种条锈菌生理小种CYR29、CYR23、CYR31和CYR32，对7M附加系、7M代换系和1003及其亲本CS、卵穗山羊草SY159进行鉴定，以辉县红和铭贤169为感病对照。结果(表2，图7)表明，卵穗山羊草对这4个条锈生理小种的反应型均为0～1级，表现为免疫或高抗；感病对照铭贤169和辉县红的反应型为4级，表现为高感；CS、7M附加系和7M(7A)代换系的反应型为3～4级，表现为中感或高感；1003对CYR29、CYR31和CYR32的反应型为3～4级，表现为中感或高感，但对CYR23的反应型为0级，表现为免疫。这表明1003携带有针对条锈生理小种CYR23的垂直抗性基因，抗性基因来源于卵穗山羊草SY159。

2.6 农艺性状调查结果

农艺性状调查结果(表3，图8)表明，1003的小穗粒数、小穗数和千粒重与亲本CS没有显著差异；其株高、小穗数、分蘖数和千粒重与亲本卵穗山羊草SY159存在显著差异(P<0.05)；株高与7M附加系或7M(7A)代换系存在显著差异(P<0.05)。总之，1003是一个综合农艺性状介于CS和SY159两亲本之间、千粒重较高、性状稳定的育种材料。

A:中国春;B:1003;C:7M附加系;D:7M(7A)代换系;红色为Oligo-pTa535探针，绿色为Oligo-pSc119.2探针；白色箭头所指为小麦的4A和5A染色体，黄色箭头所指为卵穗山羊草SY159的7M染色体。

A:CS; B:1003; C:7M additional lines; D:7M(7A) substitution lines.Red is the Oligo-pTa535 probe and green is the Oligo-pSc119.2 probe;The white arrows refer to the 4A and 5A chromosomes of wheat,and the yellow arrows refer to the 7M chromosome of theAe.geniculateRoth SY159.

图4 中国春、1003、7M附加系和7M(7A)代换系的根尖细胞FISH分析结果

Fig.4 FISH analysis results in root tip cells of CS,1003,7M additional line and 7M(7A) substitution line

A:以Oligo-44(红色)为探针对1003进行ND-FISH分析，B:以Oligo-pTa535(红色)和Oligo-pSc119.2(绿色)为探针对1003进行FISH分析；白色箭头所指为5A染色体。

A:ND-FISH analysis of 1003 with Oligo-44(red);B:FISH analysis of 1003 with Oligo-pTa535(red) and Oligo-pSc119.2(green). The white arrows refer to the 5A chromosome.

图5 1003中特定染色体的非变性荧光原位杂交(ND-FISH)分析

Fig.5 Non-denatured fluorescenceinsituhybridization(ND-FISH) analysis of specific chromosomes in 1003

1:陕优225(对照);2:中国春;3:卵穗山羊草SY159;4:1003;5:7M附加系;6:7M(7A)代换系。

1:Shanyou 225(CK);2:CS;3:Ae.geniculataRoth SY159;4:1003;5:7M addition line;6:7M(7A) substitution line.

图6 不同材料的苗期白粉病抗性表现

Fig.6Resistance to powdery mildew in differentmaterials at seedling stage

1:铭贤169(对照);2:中国春;3:卵穗山羊草SY159;4:1003;5:7M附加系;6:7M(7A)代换系。

1:Mingxian 169(CK); 2:CS; 3:Ae.geniculataRoth SY159;4:1003; 5:7M addition line; 6:7M(7A) substitution line.

图7 不同材料苗期对条锈菌生理小种CYR23的抗性表现

Fig.7Resistance of different species at seedling stage tophysiological race CYR23 of stripe rust

表2 不同材料苗期对4个条锈菌生理小种的抗性反应Table 2 Resistant response of different materials at seedling stage to four physiological races of stripe rust

-：没有数据。 -: No data.

表3 1003及其亲本和7M附加系、7M(7A)代换系的农艺性状Table 3 Agronomic traits of 1003 and its parents,7M additional line,and 7M(7A) substitution line

同列数据后小写字母不同表示不同材料间差异在0.05水平上显著。

Different lower-case letters within same column indicate significant difference between different materials at 0.05 level.

3 讨 论

3.1 1003中FISH信号的变异

染色体重排在植物进化中扮演着重要角色。Badaeva等[22]调查了208个四倍体和252个六倍体小麦种质，发现70(33.7%)个四倍体和69 (27.4%)个六倍体中存在染色体重排。Huang等[23]使用多个基于重复序列的寡核苷酸探针，通过FISH技术比较CS和373个中国品种的高分辨率核型，发现148(39.7%)个品种发生结构重排，鉴别出167个具有多态性染色体区域，表明广泛种植的小麦品种与其亲本的染色体结构重排和多态性频繁发生。在本研究中，1003中4A和5A的FISH信号与CS中4A和5A的FISH信号不一致，4A长臂顶端的绿色信号丢失，5A长臂中间的红色信号丢失，并且在相应的位置获得了绿色信号，这种改变可能是由于小麦染色体发生结构重排引起的，也可能是由于FISH信号的多态性引起的。1003中7M的FISH信号与同遗传背景的7M附加系、7M(7A)代换系中7M的FISH信号相比发生了改变，1003中的7M染色体长臂上的红色信号大部分丢失，鉴于1003、7M附加系和7M(7A)代换系对白粉病的反应型一致，推测1003中7M的FISH信号的改变并非是由重排引起的，而是FISH信号多态性的一种形式。

1:中国春;2:卵穗山羊草SY159;3:1003;4:7M附加系;5:7M(7A)代换系。

1:CS;2:Ae.geniculataRoth SY159;3:1003; 4:7M addition line;5:7M(7A) substitution line.

图8 1003与其亲本的形态性状比较

Fig.8 Comparison of agronomic traits between 1003 and its parents

3.2 1003抗病基因的来源

山羊草属与小麦的遗传关系最近[24]，山羊草属物种染色体组与小麦染色体组的同源程度高，因此向小麦中转移遗传物质比较容易。Cifuentes等[25]的研究表明，部分同源配对在小麦和山羊草的远缘杂交中广泛存在。王玉海等[26]鉴定出高抗白粉的渐渗系新种质TA002，并推测偏凸山羊草或柱穗山羊草的遗传物质是通过同源重组的途径以小片段渐渗的形式实现基因重组的。在本研究中，1003携带1对7M外源染色体，与同携带7M外源染色体的7M附加系和7M(7A)代换系对白粉菌生理小种E09的反应型一致，均为免疫，证明在7M染色体上携带着白粉病抗性基因；1003、7M附加系和7M(7A)代换系对条锈菌生理小种CYR29、CYR31和CYR32的反应型一致，均为中感至高感，表明7M染色体上未携带针对这3个生理小种的条锈病抗性基因；1003、7M附加系和7M(7A)代换系对条锈菌生理小种CYR23的反应型不一致，1003表现为免疫，7M附加系和7M(7A)代换系均表现为高感，推测1003中携带的针对条锈生理小种CYR23的抗性基因并不来源于7M染色体，鉴于1003的小麦亲本CS对条锈生理小种CYR23表现为高感，亲本卵穗山羊草SY159对条锈生理小种CYR23表现为高抗，故1003携带的针对条锈生理小种CYR23的抗性基因来源于亲本卵穗山羊草SY159，1003除携带外源染色体7M外，有可能渗入卵穗山羊草SY159其他染色体的小片段，这还有待于进一步研究证明。