石志棉 杜勤 苏雨苗 刘潇晗

中圖分类号 R931.2 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）22-3104-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.22.16

摘 要 目的：研究费氏中华根瘤菌、放射型根瘤菌和田菁茎瘤固氮根瘤菌对干旱和盐胁迫条件下穿心莲种子萌发的影响。方法：采用聚乙二醇6000（以下简称“PEG”）和氯化钠（NaCl）浸种处理，分别建立穿心莲种子的干旱胁迫和盐胁迫模型。采用培养皿纸上发芽法，考察不同浓度PEG（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/mL）和NaCl（50、100、150、200 mmol/L）对穿心莲种子萌发指标（发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数）的影响;分别采用费氏中华根瘤菌、放射型根瘤菌和田菁茎瘤固氮根瘤菌对穿心莲种子进行预处理后，同法考察其在干旱胁迫或盐胁迫条件下的各项萌发指标。结果：选取0.15 g/mL PEG溶液和50 mmol/L NaCl溶液分别构建穿心莲种子干旱胁迫和盐胁迫模型。费氏中华根瘤菌预处理可显著提高干旱胁迫条件下穿心莲种子的各项萌发指标以及盐胁迫条件下的发芽指数和活力指数，但同时可显著降低盐胁迫条件下的发芽率和发芽指数（P<0.05）;放射型根瘤菌处理可显著提高干旱胁迫条件下穿心莲种子各项萌发指标以及盐胁迫条件下的发芽势、发芽指数和活力指数（P<0.05）;田菁茎瘤固氮根瘤菌预处理可显著提高干旱胁迫条件下穿心莲种子的发芽率、发芽指数和活力指数以及盐胁迫条件下的发芽率和发芽势（P<0.05）。结论：3种根瘤菌处理均可在不同程度上改善穿心莲种子在干旱或盐胁迫条件下的发芽能力。本研究可为干旱条件下穿心莲的种植和栽培，以及将滩涂地区作为穿心莲的种植地提供技术支持。

关键词 穿心莲;种子;萌芽;根瘤菌;干旱胁迫;盐胁迫

Effects of 3 Kinds of Rhizobia on Germination of Andrographis paniculata Seed under Drought and Salt Stress Condition

SHI Zhimian，DU Qin，SU Yumiao，LIU Xiaohan（School of Pharmaceutical Sciences， Guangzhou University of TCM， Guangzhou 510006， China）

ABSTRACT   OBJECTIVE： To study the effects of Sinorhizobium fredii， Rhizobium radiobacter and Azorhizobium caulinodans on germination of Andrographis paniculata seed under drought and salt stress condition. METHODS： Drought and salt stress models of A. paniculata seed were established with PEG-6000 （called “PEG” for short）and NaCl respectively. The effects of different concentrations of PEG （0.05， 0.10， 0.15， 0.20， 0.25 g/mL） and NaCl （50， 100， 150， 200 mmol/L） on the germination indicators （germination rate， germination potential， germination index， vigor index） of A. paniculata seed were investigated by the method of germination on dish paper. The seeds were soaked with S. fredii， R. radiobacter and A. caulinodans， and then germination indicators were investigated under the condition of drought and salt stress. RESULTS： Drought and salt stress models of A. paniculata seed were established with 0.15 g/mL PEG solution and 50 mmol/L NaCl solution， respectively. S. fredii pretreatment could significantly improve all the germination indicators of A. paniculata seed under drought stress condition， as well as germination index and vigor index of it under salt stress condition， but significantly reduce germination rate and germination index of it under salt stress condition （P<0.05）. R. radiobacter treatment could significantly improve all the germination indicators of A. paniculata seed under drought stress condition， as well as germination potential， germination index and vigor index of it under salt stress condition （P<0.05）. A. caulinodans pretreatment could significantly improve germination rate， germination index and vigor index of A. paniculata seed under drought stress condition， as well as germination rate and germination potential of it under salt stress condition （P<0.05）. CONCLUSIONS： Three kinds of Rhizobia can improve germination ability of A. paniculata seed under drought or salt stress condition to different degrees. This research can provide technical support for planting and cultivation of A. paniculata under drought condition， and using saline-alkali soil as A. paniculata plantation area.

KEYWORDS   Andrographis paniculata; Seed; Germination; Rhizobia; Drought stress; Salt stress

穿心莲来源于爵床科植物穿心莲[Andrographis paniculata（Burm. f.）Nees]，以地上部分入药;其味苦，性寒，具有清热解毒、凉血、消肿等功效，临床上用于治疗感冒发热、咽喉肿痛、口舌生疮、顿咳劳嗽、泄泻痢疾、热淋涩痛、痈肿疮疡、蛇虫咬伤等[1]。穿心莲的临床应用范围广，现代药理研究显示其在心血管系统疾病、呼吸系统疾病、胃肠道系统等疾病领域均有广泛的应用前景[2-4]。穿心莲以种子繁殖，其种子细小、表面有蜡质层，种皮较坚硬、透性差，需在温暖湿润的条件下才能萌发[5]。

多种根瘤菌具有耐干旱和耐盐的特点[6]，接种于植物后能显著提高后者的抗旱性[7]，并可有效缓解盐碱胁迫对植物造成的伤害，提高植物对盐碱的耐受力[8-9]。本研究采用3种常用根瘤菌（费氏中华根瘤菌、放射型根瘤菌和田菁茎瘤固氮根瘤菌）浸种的方式，在干旱和盐胁迫条件下考察其对穿心莲种子萌发的影响，筛选出能提高穿心莲抗旱、抗盐特性的优良菌种，为发掘优良的根瘤菌种质资源以及提高穿心莲种子在干旱、盐碱环境下的萌发能力提供实验依据。现将研究结果报道如下。

1 材料

1.1 仪器

THZ-100B型恒温培养摇床（上海一恒科学仪器有限公司）;QF-PRX-160型智能人工气候箱（上海乔枫實业有限公司）;GXX-9023MBE型电热鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）;JJ300型电子天平（广州湘仪机电设备有限公司）;Basic-Q15型纯水机（上海和泰仪器有限公司）。

1.2 试剂

次氯酸钠（广州化学试剂厂，批号：20170912）;乙醇（分析纯，广州化学试剂厂，批号：20180606）;聚乙二醇6000（PEG-6000，天津市致远化学试剂有限公司，批号：20171034）;氯化钠（NaCl，广州化学试剂厂，批号：20170803-2）;水为超纯水。

1.3 菌种

费氏中华根瘤菌（Sinorhizobium fredii，编号：GIM1.227）、放射型根瘤菌（Rhizobium radiobacter，编号：GIM1.757）购自广东省微生物保藏中心;田菁茎瘤固氮根瘤菌（Azorhizobium caulinodans，编号：ORS571）由西北农林科技大学刘华伟副教授提供。

1.4 种子

穿心莲种子产自广西省玉林市兴业县，经广州中医药大学药用植物学教研室杜勤教授鉴定为爵床科植物穿心莲[A. paniculata（Burm. f.）Nees]的成熟种子。

2 方法

2.1 干旱胁迫模型的建立

选取籽粒饱满健壮、大小均匀的穿心莲种子，以75%乙醇消毒30 s后，以12%次氯酸钠溶液消毒12 min，并以无菌水冲洗4～5次。参考车代弟等[10]的研究方法，分别以0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/mL的PEG-6000（以下简称“PEG”）溶液为处理液浸泡穿心莲种子，模拟干旱胁迫条件;另设以无菌水为处理液浸泡的种子作为对照组。采用培养皿纸上发芽法萌发种子：选用直径为9 cm的培养皿，在培养皿底部放置2层纱布、1层滤纸，按照不同的处理方法分组，加入相应处理液6 mL使纱布和滤纸吸液至饱和，在每个培养皿中整齐摆放50粒种子。将培养皿和种子一起称定质量，然后置于温度28 ℃、湿度60%、12 h明/暗交替的人工气候箱中培养，每隔12 h加水至原质量。每隔24 h对萌芽的种子进行1次计数，直至连续2 d无新萌发种子为止。发芽试验结束后，以直尺测量种子的胚根和胚轴长度，并计算种子各项萌发指标（下同）[11]：发芽率（%）=发芽试验结束时正常发芽的种子数/供试种子数×100%;发芽势（%）=3 d后正常发芽的种子数/供试种子数×100%;发芽指数=浸种一定天数时的发芽数/相应的发芽天数;活力指数=发芽指数×（萌发胚根长度+胚轴长度）。上述试验重复3次。

2.2 盐胁迫模型的建立

选取籽粒饱满健壮、大小均匀的穿心莲种子，按“2.1”项下方法进行消毒和水洗。参考孙元新等[12]的研究方法，分别以50、100、150、200 mmol/L的NaCl溶液为处理液浸泡穿心莲种子，以模拟盐胁迫条件;另设以无菌水为处理液浸泡的种子作为对照组。按“2.1”项下培养皿纸上发芽法，分别采用相应的处理液进行处理后进行种子发芽试验，并在试验结束后计算种子各项萌发指标。上述试验重复3次。

2.3 解除胁迫试验

采用解除胁迫试验考察不同根瘤菌对干旱胁迫、盐胁迫条件下穿心莲种子萌发的影响。选取籽粒饱满健壮、大小均匀的穿心莲种子，按“2.1”项下方法进行消毒和水洗。然后将供试种子按250粒/瓶分别置于无菌培养瓶中，共4瓶。取生长至对数期的费氏中华根瘤菌、放射型根瘤菌和田菁茎瘤固氮根瘤菌，用无菌水稀释制成1.0×107个/mL的菌液后，分别按20 mL/瓶加至上述3个培养瓶中，浸种24 h;第4个培养瓶加入等量无菌水，同法处理，作为对照组。

以0.15 g/mL的PEG溶液和50 mmol/L的NaCl溶液为处理液（各处理液浓度根据“2.1”“2.2”项筛选结果设定），分别模拟干旱胁迫和盐胁迫条件;以无菌水作为对照组处理液。分别设置PEG对照组、NaCl对照组、PEG+费氏中华根瘤菌组、PEG+放射型根瘤菌组、PEG+田菁茎瘤固氮根瘤菌组、NaCl+费氏中华根瘤菌组、NaCl+放射型根瘤菌组、NaCl+田菁茎瘤固氮根瘤菌组，按“2.1”项下培养皿纸上发芽法，加入相应处理液6 mL使纱布和滤纸吸液至饱和，在每个培养皿整齐摆放经不同根瘤菌或无菌水处理后的种子50粒，进行种子发芽试验，并在试验结束后计算种子各项萌发指标。上述试验重复3次。

2.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。计量资料如符合正态分布，采用x±s进行描述;不符合正态分布则采用M（P25，P75）进行描述。符合正态分布且方差齐性的数据采用单因素方差分析进行组间比较;不符合正态分布且方差齐性的数据采用非参数Kruskal-Wallis H检验进行组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 干旱胁迫模型处理液浓度筛选结果

与对照组比较，采用0.05～0.25 g/mL PEG处理后，均可显著降低穿心莲种子的发芽率、发芽势和活力指数，0.10、0.20、0.25 g/mL PEG处理可显著降低其发芽指数（P<0.05）;其中，采用0.20、0.25 g/mL PEG处理后，穿心莲种子各项萌发指标降低幅度较大，详见表1。综合考虑，造模溶液需适当影响但又不过度损害种子的萌发能力，故本研究选取0.15 g/mL PEG溶液来构建穿心莲种子干旱胁迫模型。

3.2 盐胁迫模型处理液筛选结果

与对照组比较，不同浓度NaCl处理均可显著降低穿心莲种子的各项萌发指标（P<0.05）;其中，采用100～200 mmol/L NaCl处理后，穿心莲种子各项萌发指标下降幅度较大，详见表2。综合考虑，造模溶液需适当影响但又不过度损害种子的萌发能力，故本研究选取50 mmol/L NaCl溶液来构建穿心莲种子的盐胁迫模型。

3.3 不同根瘤菌对干旱胁迫条件下穿心蓮种子萌发的影响

与PEG对照组比较，费氏中华根瘤菌处理可显著提高干旱胁迫条件下穿心莲种子各项萌发指标（P<0.05），使发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数分别提高了46.02%、399.57%、69.09%、11.23%;放射型根瘤菌处理可显著提高穿心莲种子各项萌发指标（P<0.05），使发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数分别提高了22.02%、14.13%、29.61%、25.20%;田菁茎瘤固氮根瘤菌处理可显著提高穿心莲种子的发芽率、发芽指数和活力指数（P<0.05），使上述指标分别提高了28.02%、33.51%、28.64%，而对其发芽势的影响无统计学意义（P>0.05），详见表3。

3.4 不同根瘤菌对盐胁迫条件下穿心莲种子萌发的影响

与NaCl对照组比较，费氏中华根瘤菌处理可显著提高盐胁迫条件下穿心莲种子的发芽指数和活力指数（P<0.05），使两者分别提高了63.07%、208.23%，但同时可显著降低其发芽率和发芽指数（P<0.05），使两者分别降低了42.41%、21.44%;放射型根瘤菌处理可显著提高盐胁迫条件下穿心莲种子的发芽势、发芽指数和活力指数（P<0.05），使上述指标分别提高了42.87%、67.97%、216.96%，而对其发芽率的影响无统计学意义（P>0.05）;田菁茎瘤固氮根瘤菌处理可显著提高盐胁迫条件下穿心莲种子的发芽率和发芽势（P<0.05），使两者分别提高了36.36%、71.49%，而对其发芽指数和活力指数的影响无统计学意义（P>0.05），详见表4。

4 讨论

广东地区年平均春旱时间长，干旱发生率高[13]，而穿心莲喜温暖、湿润、向阳，且怕旱、怕寒，其播种期为每年3～5月，正处于广东的春旱时节[14-15]。此外，近年来人均耕地面积的减少和土地质量的下降，使得土壤盐渍化严重[16]。而广东省全省滩涂土壤面积约844.7万亩，主要分布在静水海湾和河流入海处，面积广阔，具较大的种植开拓潜力[17]。因此，开展穿心莲种子的抗干旱胁迫、抗盐胁迫对于该省发展穿心莲的播种、栽培和规模化生产具有重要的实践意义。

研究表明，在农作物上接种根瘤菌可明显提其抗盐碱[18-21]和抗干旱能力[22-24];根瘤菌还能显著提高植物种子的出苗率和发芽率[25-26]。本研究采用3种常用根瘤菌对穿心莲种子进行浸种处理，结果显示，费氏中华根瘤菌、放射型根瘤菌和田菁茎瘤固氮根瘤菌均可不同程度地提高穿心莲种子抗干旱和抗盐胁迫能力。在干旱胁迫条件下，费氏中华根瘤菌和放射型根瘤菌浸种后，种子发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数均较相应对照组显著提高;田菁茎瘤固氮根瘤菌浸种后，种子发芽率、发芽指数和活力指数均较相应对照组显著提高，仅发芽势无显著差异。在盐胁迫条件下，费氏中华根瘤菌浸种后，种子的发芽指数和活力指数均较相应对照组显著提高，但发芽率和发芽势均显著降低;放射型根瘤菌浸种后，种子的发芽势、发芽指数和活力指数均较相应对照组显著提高，但发芽率无明显差异;田菁茎瘤固氮根瘤菌浸种后，种子的发芽率和发芽势均较相应对照组显著提高，但发芽指数和活力指数无明显差异。

综上所述，3种根瘤菌处理均可在一定程度上提高穿心莲种子在干旱和抗盐胁迫条件下的萌发能力。本研究可为干旱条件下穿心莲的种植和栽培，以及将滩涂地区作为穿心莲的种植地提供技术支持。但本研究结果也显示，不同根瘤菌对不同胁迫条件下穿心莲种子各项萌发指标的改善效果有一定差异，后续拟进一步考察不同根瘤菌抗干旱胁迫/盐胁迫效果的优劣，或可考虑多种根瘤菌联合使用。

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（收稿日期：2019-06-15 修回日期：2019-09-30）

（编辑：段思怡）