祖母来提·图尔逊 马庆苓 马依努尔·拜克力

中圖分类号 R284.2 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）22-3100-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.22.15

摘 要 目的：研究新疆产胡萝卜籽超临界CO2萃取物（简称“胡萝卜籽萃取物”）的化学成分，并初步考察其抗菌和抗氧化活性，为该植物相关产品的开发及质量控制提供参考。方法：利用超临界CO2萃取法萃取新疆产胡萝卜籽中的弱极性挥发性成分。采用气质联用技术并结合标准谱库对所得萃取物的化学成分进行鉴定，以峰面积归一化法计算各成分的相对百分含量。采用微量肉汤稀释法和琼脂培养基平板法考察胡萝卜籽萃取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌的抗菌活性，同时采用薄层色谱-生物自显影法考察其抗氧化活性。结果：胡萝卜籽萃取物中共鉴定出20个化学成分（总相对百分含量为98.76%），主要成分为β-红没药烯、α-细辛脑、α-蒎烯、β-丁香烯、绵马酚等。胡萝卜籽萃取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌均具有一定的抑制作用，其最低抑菌浓度分别为0.039、0.833、0.625 mg/mL，最低杀菌浓度分别为0.078、1.667、1.250 mg/mL;该萃取物对1，1-二苯基乙-三硝基苯肼（DPPH）自由基具有一定的清除能力。结论：超临界CO2萃取所得的新疆胡萝卜籽萃取物中含有复杂的单萜和倍半萜烯类化合物，并具有一定的抗菌和抗氧化活性。

关键词 新疆;胡萝卜籽;超临界萃取;气质联用技术;化学成分;抗菌活性;抗氧化活性

Analysis of Chemical Constituents of Supercritical CO2 Extract from Xinjiang Daucus carota Seed and Its Antibacterial and Antioxidant Activities Study

Zumret·Tursun，MA Qingling，Mahinur·Bakri（Key Lab of Plant Resources and Chemistry in Arid Regions，Chinese Academy of Sciences & National Key Laboratory Breeding Base of Xinjiang Indigenous Medicinal Plants Resource Utilization & Xinjiang Technical Institute of Physics and Chemistry， Chinese Academy of Sciences， Urumqi 830011， China）

ABSTRACT   OBJECTIVE： To study the chemical constituents of supercritical CO2 extract from Xinjiang Daucus carota seed（called “D. carota seed extract” for short）， and to preliminarily evaluate its antimicrobial and antioxident activity， so as to provide reference for the development and quality control of related products of the plant. METHODS： The non-polar volatile part of Xinjiang D. carota seed was extracted by supercritical CO2 extraction method. The chemical constituents of the extract were identified and quantified by GC-MS and standard spectral labrary. The relative percentage content of each component was calculated by peak area normalization method. The antibacterial activity of D. carota seed extract against Staphylococcus aureus，Escherichia coli and Candida albicans were investigated by trace broth dilution method and AGAR medium plate method. Its antioxidant activity was investigated by TLC-bioautography method. RESULTS： Twenty chemical constituents were identified from D. carota seed extract （the total relative percentage content was 98.76%）， mainly including β-bisabolene， α-asarone， α-pinene， β-caryophyllene， aspidinol， etc. D. carota seed extract has certain antimicrobial activity on S. aureus， E. coli and C. albicans. The minimum inhibitory concentrations were 0.039， 0.833， 0.625 mg/mL， and minimum bactericidal concentrations were 0.078， 1.667， 1.250 mg/mL， respectively. The extract has a certain scavenging ability to DPPH radical. CONCLUSIONS： D. carota seed extract obtained by supercritical CO2 extraction contains monoterpenes and sesquiterpenes， and possesses certain antibacterial and antioxidant activity.

KEYWORDS   Xinjiang; Daucus carota seed; Supercritical CO2 extraction;GC-MS;Chemical component; Antibacterial activity; Antioxidant activity

胡萝卜（Daucus carota L.）是伞形科胡萝卜属植物，有“地下小人参”之称。胡萝卜籽是胡萝卜的干燥成熟果实，其药用记载始于明代的《本草纲目》，是我国习用传统中药。胡萝卜籽在新疆民间常用于利尿通淋、祛寒通经、调理经水、化排结石，已收载于《中华本草（维吾尔药卷）》[1]中。不同产地同一种植物的化学成分和生物活性往往存在较大区别[2]。新疆产胡萝卜不仅资源丰富，还因其如较大昼夜温差等特殊的生长环境，故而具有独特的口感[3]，而这些特性与其化学成分具有密切的关联。然而，笔者经文献检索发现，新疆产胡萝卜籽化学成分研究很少，只有对胡萝卜籽脂肪酸成分或微量元素的分析测定[4-5]，或对其挥发油进行分析[6]，但对其中具体的弱极性挥发性成分的研究较少。为了扩大新疆产胡萝卜籽的药用部位，充分开发利用其自然资源，本研究以新疆产胡萝卜籽为原料，采用超临界二氧化碳（CO2）流体萃取法提取胡萝卜籽中的弱极性挥发性成分，并利用气质联用技术（GC-MS）进行分离和分析，再分别考察萃取物的抗菌活性和抗氧化活性，以期为新疆产胡萝卜相关产品的开发及质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

FW-100型高速粉碎机（北京市永光明医疗仪器厂）;CPA 124S型电子天平（德国Sartorius公司）;SpeedTM SFE-2型超临界流体萃取仪（美国Appelied Saparations公司）;Auto System XL GC-TurboMass型GC-MS仪（美国Perkin Elmer公司）;HZ200LB型恒温摇床（上海精胜科技仪器有限公司）;SPX-250B-Z型生化培养箱（上海精若科学仪器有限公司）;ATS4型全自动点样仪、Visua- lizer型薄层色谱成像系统（瑞士CAMAC公司）。

1.2 药品与试剂

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，美国Sigma公司）;M-H 琼脂培养基（北京索莱宝科技有限公司，批号：20180817）;沙氏琼脂培养基（青岛尼赛欣合生物技术有限公司，批号：20181025）;HPTLC正相硅胶60 F254玻璃板（20 cm×10 cm，德国Merck公司）;CO2（新疆康迪实业发展有限公司，纯度：≥99.5%）;灭菌0.9%生理盐水（自制）;氯化钠、无水乙醇、正己烷、乙酸乙酯、甲酸、二甲基亚砜（DMSO）均为分析纯，购自天津市百世化工有限公司;水为蒸馏水。

1.3 药材

胡萝卜籽购自新疆恩萨尔维吾尔医饮片药业有限公司（批号：HLBZ-YP-170926），经中国科学院新疆理化技术研究所鲁春芳副研究员鉴定为伞形花科植物胡萝卜属植物胡萝卜（D. carota L.）的新鲜种子。

1.4 标准菌株

金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、大肠杆菌（ATCC 11229）、白色念珠菌（ATCC 10231）均由广东省微生物培养中心提供。

2 方法

2.1 胡萝卜籽中弱极性挥发性成分的萃取

选用胡萝卜籽，精选除去杂质，以适量水清洗1次，自然风干12 h，粉碎过筛（40目）。取胡萝卜籽粉末1 kg，以CO2为溶媒，采用超临界CO2萃取法以超临界流体萃取仪进行萃取。设置萃取釜体积为5 L、萃取压力为10 MPa，萃取温度为28 ℃，萃取时间为2 h;分离釜Ⅰ的压力为6 MPa、温度为30 ℃;分离釜Ⅱ的压力为6 MPa、温度为34 ℃;CO2的流量为20 kg/h。每0.5 h收集1次萃取物，合并有特殊气味的淡黄色透明油状溶液，即得胡萝卜籽超临界CO2萃取物（以下简称“胡萝卜籽萃取物”）。共收集获得胡萝卜籽萃取物73 g，收率为7.3%。

2.2 胡萝卜籽萃取物的成分分析

采用GC-MS法进行分析。

2.2.1 色谱条件 色谱柱：PE-5MS石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）;载气：氦气;柱前压：14 kPa;程序升温：柱温80 ℃保持5 min，以1.5 ℃/min升至200 ℃，再以2.5 ℃/min升至250 ℃，保持30 min;进样口温度：270 ℃;进样量：0.5 μL，分流比：20 ∶ 1。

2.2.2 质谱条件 离子源：电子轰击离子源（EI）;碰撞电子能量：70 eV;离子源温度：180 ℃;传输线温度：280 ℃;扫描范围：35～500 amu。

2.2.3 弱极性挥发性成分的结构确证及含量计算 采用NIST 2014质谱数据库软件对检测到的原始GC-MS图谱进行化学成分检索匹配，并结合相关文献，人工解析质谱图谱，鉴定并确证化合物结构;同时，采用峰面积归一法计算各化学成分的相对百分含量。

2.3 胡萝卜籽萃取物的抗菌活性考察

2.3.1 菌种的复苏及菌悬液的制备 按无菌操作法[7-8]，将各标准菌株接种至相应的培养基上进行复苏（细菌用M-H琼脂培养基在37 ℃条件下培养18～24 h;真菌用沙氏琼脂培养基在37 ℃条件下培养 24～48 h），转接到新鲜培养基1次。用灭菌生理盐水调整菌悬液浓度约为1.5×108 CFU/mL;再取少量菌悬液，按100倍稀释法用灭菌生理盐水稀释至1.5×106 CFU/mL，备用。

2.3.2 胡萝卜籽萃取物的最低抑菌浓度（MIC）测定采用微量肉汤稀释法[9-11]进行测定。按无菌操作法[7-8]，取一次性无菌96孔板（每排12孔），分别加入M-H 肉汤培养基100 μL，然后取质量浓度为20 mg/mL的胡萝卜籽萃取物药液（以DMSO为溶剂配制）100 μL加入第1孔，混匀后吸取100 μL加入第2孔，如此连续倍比稀释至第10孔，第10孔中吸取100 μL弃去，上述10个孔作为试验组;第11孔只加培养基和菌液，作为生长对照组，用以观察培养基是否适合菌株生长;第12孔只加培养基，作为培养基对照组，用以观察培养基是否被污染。另吸取1.5×106 CFU/mL的菌悬液各100 μL，依次加入到上述1～11孔中，于摇床上充分混匀，各孔菌浓度均为7.5×105 CFU/mL;吸取M-H肉汤培养基100 μL加入到第12孔中，于摇床上充分混匀。将96孔板加盖后置于37 ℃培养箱中培养18～24 h，取出观察菌株生长情况。在黑色背景光源下，若与生长对照组中生长特性相同（如肉汤浑浊或孔底出现浑浊），则判断为有菌生长。以无菌生长试验孔所对应的最低药物质量浓度记为该药物的MIC。每种菌株平行操作3次。

2.3.3 胡萝卜籽萃取物的最低杀菌浓度（MBC）测定采用琼脂培养基平板法[10]进行测定。分别从“2.3.2”项下未见细菌生长的孔中吸取培养液100 μL，分别接种至M-H琼脂培养基中，用无菌棉签均匀涂布，置于37 ℃培养箱中培养18～24 h。用活菌计数法检查平板上菌落，以每皿平均菌落数小于5对应的最低药物质量浓度记为该药物的MBC。每种菌株平行操作 3次。

2.4 胡萝卜籽萃取物的抗氧化活性考察

采用薄层色谱（TLC）-生物自显影技术[12-13]进行考察。将胡萝卜籽萃取物用无水乙醇稀释100倍，分别精密量取1、2、3、4、5 μL点样于10 cm×10 cm的薄层硅胶板上，然后以正己烷-乙酸乙酯-甲酸（3 ∶ 1 ∶ 05，V/V/V）为展开系统进行展开，晾干，分别在366、254 nm紫外灯下观察斑点的数量和大小。

取上述展开后的薄层板，喷以含0.04%DPPH的乙醇溶液，于40 ℃下加热30 min后在自然光下观察[12-13]。在薄层板粉色背景下，样品展开后的白色斑点颜色越深、面积越大，则表明该成分对DPPH 自由基的清除活性越强，以评价药物的抗氧化活性。

3 结果

3.1 胡萝卜籽萃取物的GC-MS分析结果

经GC-MS分析，获得胡萝卜籽萃取物的总离子流图（见图1）。结合质谱图，经计算机检索并结合文献调研，共鉴定出20个化合物;同时，经峰面积归一化法计算其相对百分含量，所鉴定出的化合物总相对百分含量为98.76%，结果见表1。

3.2 胡萝卜籽萃取物的抗菌活性

抗菌试验结果显示，胡萝卜籽萃取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌均有不同程度的抑制作用，详见表2。

3.3 胡萝卜籽萃取物的抗氧化活性

在366、254 nm紫外灯下可以看到8个清晰斑点，分离效果较好，表明胡萝卜籽萃取物中各个成分得到了有效分离，详见图2A、2B。经DPPH反应后显示，8个斑点均呈不同深浅的白色，表明胡萝卜籽萃取物中的大部分化学成分都具有DPPH自由基清除能力，提示其具有一定的抗氧化活性，详见图2C。

4 讨论

胡萝卜籽虽在古籍中早有记载，具有明显的防治疾病和增强机体免疫能力，但目前在保健和医疗领域的应用很少，市场上主要的相关保健产品有胡萝卜汁、胡萝卜营养咀嚼片、胡萝卜保健酒等[14]。中医药是中华民族的瑰宝，国家鼓励运用现代科学技术和传统中医药研究方法开展中医药科学研究，以促进中医药理论和技术方法的继承和创新。胡萝卜籽作为传统的药食同源类中药，研究者应充分利用其活性成分，开发为功能性食品、药品、保健品等，使该植物资源的利用价值最大化。

本研究采用超临界CO2萃取新疆产胡萝卜籽的弱极性挥发性部位，并通过体外活性测试方法证实其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌均具有抑制活性，对DPPH自由基具有明显的清除能力，这与其化学成分有关。GC-MS分析结果显示，胡萝卜籽萃取物中含有大量复杂的单萜和倍半萜烯类化合物，主要包括β-红没药烯、α-细辛脑、α-蒎烯、β-丁香烯、绵马酚等活性成分。其中，β-红没药烯是一种很好的抗氧化剂，具有抗氧消炎之功效[15];α-细辛脑具有抗菌消炎、止咳、祛痰、平喘、镇静、解痉、抗惊厥、抗癫痫等药理作用[16];α-蒎烯有明显的镇咳和祛痰作用，并有抗真菌作用;β-丁香烯具有一定的平喘作用，是治疗老年慢性支气管炎的有效成分之一[17];绵马酚具有抗微生物、驱虫作用，在临床上可用作驱肠虫剂[18];α-石竹烯具有一定的平喘作用，可用于治疗老年慢性支气管炎;石竹烯氧化物则可治疗皮肤霉菌病，尤其适用于短期治療甲霉菌病，同时还具有祛风除湿、清热解毒、利尿消肿的功效[19]。

综上，本研究通过对新疆产胡萝卜籽超临界CO2萃取物化学成分的分析及其抗菌、抗氧化等生物活性的初步评价，为新疆产胡萝卜资源的合理利用提供了一定依据。但该植物中具有抗菌和抗氧化活性的具体有效成分及其机制仍有待进一步研究。

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（收稿日期：2018-11-29 修回日期：2019-09-27）

（编辑：段思怡）