彭耀中，杜鹏，张学勇

聊城市第二人民医院1检验科，2肿瘤科，山东聊城252600

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器

人脑胶质瘤U87细胞系购自美国模式菌种收集中心（American TypeCultureCollection，ATCC）。TMZ、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-CdR）、膜联蛋白V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）细胞凋亡试剂盒均购自美国Sigma公司，噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl tetrazolium，MTT）、LipofectamineTM2000试剂均购自美国Invitrogen公司，DMEM高糖培养基购自美国Gibco公司，Trizol试剂购自美国Life Technology公司，聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）引物、pcDNA-DNMT1过表达载体均购自生工生物工程（上海）股份有限公司，实时定量聚合酶链反应（realtime quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）仪购自美国BD公司，RNA提取试剂盒、TaqMan®miRNA试剂盒、SYBR Green PCR Master Mix试剂盒、细胞凋亡试剂盒均购自美国Omega生物公司。

1.2 实验方法

1.2.1 U87/TMZ耐药细胞培养将人脑胶质瘤U87细胞系培养在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，24～48 h更换培养液，48 h传代一次。收集对数生长期的人脑胶质瘤U87细胞系，1000 r/min离心5 min，弃去培养液，调整浓度为1×107/ml，加入含有10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后，加入5 μmol/L诱导剂量的TMZ，培养15～20天后，采用终浓度为10、20、40、80、160、320 μmol/L的TMZ溶液处理细胞，每个梯度浓度培养15～20天，最终获得稳定生长的U87/TMZ耐药细胞系，TMZ最佳浓度为20 μmol/L。

1.2.2 流式细胞仪检测U87细胞和U87/TMZ耐药细胞的凋亡情况采用20 μmol/L的TMZ分别作用于U87细胞和U87/TMZ耐药细胞，胰蛋白酶消化后置入离心管中，2000 r/min离心5 min，除去上清液。采用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗 3次，加入 400 μl的结合缓冲液（binding buffer）重悬细胞，加入5μl的 Annexin VFITC，4℃避光孵育20 min。上机检测前5 min，加入5 μl的PI染液，采用流式细胞仪检测U87细胞和U87/TMZ耐药细胞的凋亡情况。实验重复3次。

1.2.3 RT-PCR法检 测MDR1、DNMT1、Bcl-2mRNA和miRNA-148b-3p的相对表达量取对数生长期的U87细胞和U87/TMZ耐药细胞，Trizol法提取总RNA，测定mRNA浓度和纯度，根据反转录试剂盒说明合成互补DNA（complementary DNA，cDNA），根据荧光定量RT-PCR试剂盒说明书进行扩增。反应条件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，循环45次，以β-actin作为内参，采用2-△△Ct法计算MDR1、DNMT1、Bcl-2mRNA和miRNA-148b-3p的相对表达量。引物序列如下：MDR1正向引物为5'-CTTGGCATTGAGTGAAAGAAC-3'，反向引物为5'-ACAGGAGATAGGCTGGTTTGA-3'；Bcl-2正向引物为 5'-CATTGGGAGTTTCAAATCAGC-3'，反向引物为5'-CTTTGCATTCTTGGACGAGG-3'；DNMT1正向引物为5'-CTCCCTATTGTAAACTTGT-3'，反向引物为5'-ATAGGGTTCATTCCCATACG-3'；miRNA-148b-3p正向引物为5'-TGACTGGATTCGCTAGGTAGAAG-3'，反向引物为 5'-GGCAATTTTCAGAGCTATTAG-3'。

1.2.4 DNMT1抑制剂5-Aza-CdR处理U87细胞取对数生长期的U87细胞，加入2 μ mol/L的DNMT1抑制剂5-Aza-CdR处理24 h，收集细胞，RT-PCR法检测miRNA-148b-3p的相对表达量。

1.2.5 U87/TMZ耐药细胞转染和分组方法转染前1天，将U87/TMZ耐药细胞接种至6孔板，5×105/孔，培养24 h，待融合度为50%～60%时，将空质粒、LipofectamineTM2000试剂和pcDNA-DNMT1过表达载体分别转染至U87/TMZ耐药细胞，并分别作为空白对照组、阴性对照组和pcDNA-DNMT1组，37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24～48 h。

1.2.6 甲基化特异性聚合酶链反应（methylation specific polymerase chain reaction ，MSP）法检测U87/TMZ耐药细胞miRNA-148b-5p启动子区甲基化水平取对数生长期的空白对照组、阴性对照组和pcDNA-DNMT1组U87/TMZ耐药细胞，Trizol法提取总RNA，取800 μl去离子水加入至亚硫酸氢钠混合物中，充分混匀、溶解。配置140 μl反应体系：85μl亚硫酸氢钠混合物，35 μl DNA缓冲液，5 μl DNA 溶液，15 μl RNase-free水；反应条件：95℃ 5 min，60℃ 25 min，95℃ 5 min，60℃ 85 min，95℃5 min，60℃175 min。然后将反应液转移至离心管中，加入560 μl新鲜配制的缓冲液，混匀；将反应产物分别装入离心管中；3000 r/min离心5 min，除去收集柱中的液体；65℃烤箱中烘干；洗涤，收集离心管中的反应产物，将反应产物置于-80℃保存备用。将20 μl的反应体系（Taq Mix10 μl+cDNA模板2 μl+上下游引物1 μl+7 μl RNase-free水），反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸5 min，循环40次。以β-actin作为内参，采用2-△△Ct法计算3组U87/TMZ耐药细胞miRNA-148b-3p启动子区甲基化水平。

1.2.7 MTT法检测U87/TMZ耐药细胞的增殖能力取对数生长期的空白对照组、阴性对照组和pcDNA-DNMT1组U87/TMZ耐药细胞，接种至96孔板中，1×104/孔，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中进行培养，每组设置8个复孔，培养24 h后，分别加入终浓度为 10、20、40、80、160 μmol/L（因预实验显示，160 μmol/L 的 TMZ处理细胞时，pcDNA-DNMT1组细胞的增殖抑制率已经达到平台期，因此，未采用320 μmol/L的TMZ处理细胞）的TMZ溶液，培养48 h后，每孔加入20 μl的MTT，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育4 h后，弃除上清液，每孔加入200 μl的DMSO溶液，置于振动器上振动5 min，置于显微镜下观察无紫色结晶物。采用酶标仪于570 nm的波长处测量光密度（optical density，OD）值，计算细胞增殖抑制率，增殖抑制率（%）=1-OD值TMZ处理组/OD值空白组×100%。实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件对所有数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验，两组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

利用GRNN网络进行的瓦斯涌出预测结果接近实际值，最大误差仅有8%左右，可以用于瓦斯涌出量预测的实际生产中去[6]。在整个网络的训练中，GRNN网络需要调整的参数只有一个光滑因子，因而有较快的收敛速度，可以更快地训练出合适的网络。在调用GRNN网络时，需要输入的设计参数只有一个扩展常数，使得网络的形成受到的人为主观影响较小，使得在预测中有更大的优势。

2 结果

2.1 流式细胞仪检测U87细胞和U87/TMZ耐药细胞的凋亡情况

经20μmol/L的TMZ处理U87细胞和U87/TMZ耐药细胞后，U87/TMZ耐药细胞的凋亡率为（1.84±1.11）%，明显低于 U87细胞的（15.47±2.09）%，差异有统计学意义（t=16.291，P＜0.01）。

2.2 MDR1、Bcl-2mRNA相对表达量的比较

U87/TMZ耐药细胞中MDR1mRNA的相对表达量为（2.26±0.19），明显高于U87细胞的（0.65±0.14），差异有统计学意义（t=19.295，P＜0.01）。U87/TMZ耐药细胞中Bcl-2mRNA的相对表达量为（1.34±0.15），明显高于U87细胞的（0.73±0.16），差异有统计学意义（t=7.867，P＜0.01）。

2.3 DNMT1mRNA和miRNA-148b-3p相对表达量的比较

U87细胞miRNA-148b-3p的相对表达量为（0.63±0.18），明显低于 U87/TMZ耐药细胞的（2.44±0.15），差异有统计学意义（t=21.849，P＜0.01）。U87细胞DNMT1mRNA的相对表达量为（1.15±0.17），明显高于 U87/TMZ耐药细胞的（0.84±0.13），差异有统计学意义（t=4.097，P＜0.01）。

2.4 DNMT1抑制剂5-Aza-CdR对U87细胞miR-NA-148b-3p相对表达量的影响

5-Aza-CdR处理后的U87细胞的miRNA-148b-3p相对表达量为（1.84±0.12），明显高于未经5-Aza-CdR处理的U87细胞的（0.57±0.10），差异有统计学意义（t=22.996，P＜0.01）。

2.5 MSP法检测U87/TMZ耐药细胞miRNA-148b-5p启动子区的甲基化水平

MSP法检测结果显示，pcDNA-DNMT1组U87/TMZ耐药细胞中miRNA-148b-3p启动子区甲基化水平为（0.64±0.17），高于空白对照组的（0.43±0.12）和阴性对照组的（0.45±0.11），差异均有统计学意义（t=2.854、2.654，P＜0.05）。

2.6 MTT法检测U87/TMZ耐药细胞的增殖能力

不同浓度TMZ溶液处理的pcDNA-DNMT1组U87/TMZ细胞的增殖抑制率，均明显高于空白对照组和阴性对照组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 不同浓度TMZ处理 3组 U87/TMZ耐药细胞增殖抑制率的比较（%，±s）

表1 不同浓度TMZ处理 3组 U87/TMZ耐药细胞增殖抑制率的比较（%，±s）

注：a与空白对照组比较，P＜0.01；b与阴性对照组比较，P＜0.01

TMZ浓度（μmol/L）10 20 40 80 160 1.29±1.20 3.50±1.36 18.24±4.65 43.77±8.10 54.89±8.79 2.33±1.15 4.38±1.40 17.26±4.81 42.18±7.25 53.46±8.12 14.48±3.47a b 20.04±4.18a b 45.85±7.31a b 78.81±6.05a b 79.26±6.80a b空白对照组阴性对照组pcDNA-DNMT1组

3 讨论

对于恶化程度较高的胶质瘤患者，临床多采用手术联合放化疗的综合治疗方案，其中烷化剂是最常用的化疗药物，TMZ属于第二代咪唑并四嗪类烷化剂，且是临床治疗脑胶质瘤的一线化疗药物[6]。TMZ口服后可代谢为5-（3-甲基三氮烯-1-基）咪唑-4-甲酰胺，导致肿瘤细胞DNA中鸟嘌呤的O6位和N7位发生甲基化，从而发挥细胞毒性作用[7]。但在实际临床中，超过30%的患者易对TMZ产生耐药性，是脑胶质瘤患者化疗失败的主要原因。寻找预防高TMZ耐药性的靶点，是进行个体化治疗、提高患者预后的关键。

近年来，随着基因组学和表观遗传学的不断发展，基因甲基化与肿瘤发生发展的关系成为肿瘤领域研究的热点。与遗传学改变不同，基因甲基化过程中核苷酸序列未发生变化，而是通过DNA甲基化、染色体重构和组蛋白去乙酰化等调控相关基因的表达，参与机体的病理生理过程[8]。DNA甲基化在调控肿瘤发生发展过程中发挥重要作用，其可通过调控癌基因或抑癌基因的表达，参与肿瘤细胞生长、增殖、凋亡等生物学过程[9]。本研究首先通过梯度浓度化疗药物递增诱导法建立了人神经胶质瘤细胞U87对TMZ耐药的细胞系，即U87/TMZ耐药细胞系，并通过检测MDR1、Bcl-2mRNA的相对表达量验证细胞对TMZ的耐药性。MDR1基因编码的P糖蛋白可在细胞内形成药泵，从而将化疗药物泵出细胞外，从而使细胞产生耐药性；同时P糖蛋白可以使细胞内环境碱化，以降低细胞对化疗药物的敏感性[10]。Bcl-2基因则属于细胞凋亡相关基因，与抑制肿瘤细胞凋亡密切相关，Bcl-2表达上调，肿瘤细胞药物抗性增强[11]。本研究中，U87/TMZ耐药细胞中MDR1、Bcl-2mRNA的相对表达量均明显高于U87细胞，表明U87/TMZ细胞具有较强的TMZ耐药性。

脑胶质瘤对TMZ的耐药机制较为复杂，除与DNA损伤修复途径有关外，表观遗传调控也在其中发挥着关键作用[12]。近年来，miRNA与化疗药物的敏感性和耐药性密切相关已被临床广泛认可。在前期研究中，研究小组通过靶基因预测数据库Target Scan和microrna，发现miRNA-148b-3p与DNMT1存在互补序列，推测二者可能存在靶向关系[13]。miRNA-148b是近年来新发现的miRNA，属于miRNA-148家族成员之一，在不同组织中的表达水平存在明显差异[14]。前体miRNA-148b定位于染色体12q13.13，包括miRNA-148b-3p和miRNA-148p-5p[15]。既往研究表明，miRNA-148b-3p通过靶向WNT1/β-catenin信号通路，抑制肝癌细胞的增殖和侵袭[16]。在本研究中，U87细胞中miRNA-148b-3p的相对表达量明显低于U87/TMZ耐药细胞，但DNMT1miRNA的相对表达量却明显高于U87/TMZ耐药细胞，将DNMT1抑制剂5-Aza-CdR作用于U87细胞，发现U87细胞miRNA-148b-3p的相对表达量明显升高；同时，将pcDNA-DNMT1过表达载体转染至U87/TMZ耐药细胞珠，结果显示，U87/TMZ耐药细胞miRNA-148b-3p启动子区域甲基化水平升高。表明DNMT1基因可能通过调节miRNA-148b-3p启动子区域甲基化水平调节miRNA-148b-3p的相对表达量，从而进一步影响肿瘤细胞的增殖能力。DNMT1介导的DNA甲基化是表观遗传学基因调控的重要手段，在人神经胶质瘤细胞对TMZ耐药过程中发挥关键作用[17]。

综上所述，DNMT1与miRNA-148b-3p的表达密切相关，DNMT1可通过调节miRNA-148b-3p启动子区甲基化水平负性调控miRNA-148b-3p的相对表达量，从而控制人脑胶质瘤细胞对TMZ的耐药性。miRNA-148b-3p可能作为预测脑胶质瘤对TMZ治疗敏感性的参考指标之一，为临床个体化治疗提供新的思路。