耿文文，蒲 倩，高海东

山东大学齐鲁医院（青岛）普外科，山东 青岛 266000

肿瘤转移是一个复杂而有序的过程，主要包括：瘤细胞从原发瘤解离，穿过细胞外基质，侵入血管，在血循环中生存，侵出血管，并在远隔部位增殖形成微灶，继续生长最终形成临床可见的转移灶，瘤细胞必须完成所有这些过程才能形成转移瘤［1］。在整个过程中，肿瘤细胞首先需要获得侵袭和移动能力才有可能启动转移，因此这一步骤被认为是肿瘤转移过程中的限速步骤，而上皮-间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）过程又是其中的关键步骤［2］，在肿瘤的侵袭和转移过程中有重要意义，阻止恶性上皮细胞的EMT过程则有可能成为阻止肿瘤转移的新思路。Runx2是多瘤病毒增强子结合蛋白2/核心结合因子（polyomavirus enhancer binding protein 2/core binding factor，PEBP2/CBF）转录因子家族的成员，可以调节基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）和骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein，BSP）等肿瘤转移相关蛋白的表达［3］。研究表明，Runx2是转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）通路中重要的组成部分，而TGF-β通路在肿瘤细胞EMT过程中具有重要的作用［4-5］，所以本研究着重探讨TGF-β诱导的EMT过程以及Runx2在其中发挥的作用。

1 材料和方法

1.1 主要试剂及细胞系

人肺癌细胞系A549由天津医科大学附属肿瘤医院中心实验室惠赠，传代培养于RPMI-1640培养液中，在37 ℃、CO2体积分数为5%、饱和湿度的条件下贴壁生长。RPMI-1640及胎牛血清购于美国Hyclone公司；TGF-β1购自美国PeproTech公司；纤维连接蛋白（fibronectin）抗体、Runx2抗体、E-cadherin抗体和波形蛋白（vimentin）抗体购自美国Abcam公司，p-Smad2/3抗体、p-AKT抗体（Cell Signaling USA）和p-ERK1/2抗体购自美国Cell Signaling公司，β-actin单克隆抗体（鼠抗人）、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记山羊抗兔多克隆抗体和HRP标记山羊抗鼠多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；脂质体转染试剂LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司，LY294002［磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositide3-kinases/protein kinase B，PI3K/AKT）通路抑制剂］、PD98059［丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase，MAPK/ERK）通路抑制剂］和Runx2-siRNA购自美国Selleck公司。

1.2 TGF-β1诱导EMT实验［6］

EMT是具有极性的上皮细胞转换成具有活动能力、能够在细胞基质间自由移动的细胞的过程。该过程包括细胞形态学的改变及基因型的改变，具体包括：① 细胞黏附分子如E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达减少，导致立方上皮细胞失去细胞间相互作用，细胞极性丧失；② 立方上皮细胞的细胞角蛋白结构改变，外形演变为纺锤形纤维细胞形态；③ 获得了纤维原细胞或间质细胞的“特性”，包括vimentin及其他间质蛋白如fibronectin表达的上调，细胞获得较强的侵袭和移动能力。

将A549细胞消化离心后制成细胞悬液，向6孔板中接种，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养。使细胞生长均匀，直至贴壁。待显微镜下观察细胞已长至6孔板底壁的80%左右，向瓶中加入约2 mL RPMI-1640培养液，饥饿细胞12 h过夜后加入TGF-β1母液，将浓度调整为0.0、0.5、1.0、2.5、5.0和10.0 ng/mL。将6孔板置于 37 ℃、CO2体积分数为5%的温箱中培养，设不同的时间点（0、12、24、48、72和96 h）观察细胞形态变化并拍照。

1.3 脂质体介导的真核细胞siRNA转染

以不含血清和抗生素的RPMI-1640培养基 5 0 0 μ L 分别稀释两种s i R N A 母液及非特异性siRNA母液至终浓度为10 nmol/L，此为A液，室温放置5 min；以不含血清和抗生素的RPMI-1640培养基500 μL分别稀释10 μL的LipofectamineTM2000三管，此为B液，室温放置5 min。分别轻柔混合AB液，室温放置20 min，将混匀后的AB液分别均匀地滴入含4 mL RPMI-1640培养基（不含血清和抗生素）的细胞培养皿中，混匀，放入细胞培养箱内。转染后6 h更换完全培养基继续培养，分别收集转染24、48、72和96 h的细胞，采用蛋白质印迹法（Western blot）鉴定Runx2蛋白的抑制效果，筛选最佳的干扰序列、作用时间和干扰浓度。

1.4 Western blot检测蛋白水平

消化收集各组的细胞，提取细胞蛋白后应用BCA蛋白定量法测定蛋白含量。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离蛋白，于冰上湿转，转膜后置于含5%牛血清白蛋白的洗膜缓冲液（TRIS-buffered saline Tween，TBST）中封闭2 h，加入一抗，4 ℃温育过夜，TBST振荡洗膜10 min×3次，以封闭液稀释的HRP标记的山羊抗小鼠及山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）室温温育1 h，TBST洗膜10 min×3次。于暗室中加入ECL显色液曝光，采用Image J进行灰度分析

1.5 统计学处理

所获数据应用SPSS 18.0统计软件进行分析，结果采用ANOVA单因素方差分析，两组组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TGF-β1可以诱导A549细胞发生EMT

首先根据相关研究［6］确定了TGF-β1诱导肺癌细胞系A549发生EMT形态变化的最佳浓度和时间，分别利用不同浓度（0.0、0.5、1.0、2.5、5.0和10.0 ng/mL）TGF-β1诱导细胞，在不同时间点（0、12、24、48、72和96 h）利用相差光学显微镜评估TGF-β1诱导的细胞形态学变化。结果显示，5 ng/mL TGF-β1在48 h可以使A549细胞发生形态改变，72 h之后更加显著。A549细胞培养在空白对照组呈现经典的鹅卵石上皮形态和生长模式，但是经过5 ng/mL TGF-β1处理后，细胞形态逐渐变为长梭形，极性丧失，细胞变得离散，呈现更多的纤维母细胞形态并减少了细胞间的连接（图1）。同时，在TGF-β1 5 ng/mL诱导细胞48 h后，与对照组相比，实验组中细胞黏附分子E-cadherin蛋白水平下降（P＜0.05），而间质蛋白vimentin、fibronectin表达显著上调（P＜0.05），证明在此过程中TGF-β1诱导A549细胞发生了EMT。与对照组相比，Runx2的表达也发生上调，差异有统计学意义（P＜0.05，图2）。

2.2 干扰Runx2表达可以抑制肿瘤细胞发生EMT

设立空白对照组、TGF-β1组及siRunx2干扰组，后两组分别利用5 ng/mL TGF-β1处理细胞，48 h后观察细胞形态学改变并检测EMT相关蛋白的表达变化。与空白对照组相比，TGF-β1组细胞发生形态学改变，细胞形态逐渐变为长梭形，极性丧失，细胞变得离散（图3）；而经过Runx2-siRNA处理下调Runx2表达的细胞，加入TGF-β1刺激细胞之后，与对照组相比细胞并没有出现明显的形态变化。TGF-β1刺激细胞48 h后细胞的间质蛋白vimentin、fibronectin表达上调，而上皮蛋白E-cadherin表达下降，差异有统计学意义 （P＜0.05）；而经过Runx2-siRNA处理下调Runx2的表达的细胞，加入TGF-β1刺激，EMT相关标志蛋白E-cadherin、vimentin、fibronectin表达未发生明显变化，差异无统计学意义 （P＞0.05，图4）。由此可见，干扰Runx2表达抑制TGF-β1诱导A549肿瘤细胞发生EMT。

图 1 TGF-β1诱导的EMT过程中A549细胞形态变化Fig. 1 Morphological changes of A549 cells induced by TGF-β1 in the EMT process

图 2 5 ng/mL 的TGF-β1作用于细胞48 h后，EMT相关标志蛋白及Runx2蛋白的表达变化Fig. 2 Comparison of EMT-related marker expression and Runx2 in response to 5 ng/mL TGF-β1 after 48 h

2.3 TGF-β1诱导A549细胞发生EMT过程中，激活了Smad2通路及旁路PI3K/AKT和MAPK/ERK通路

设立空白对照组及实验组，实验组利用5 ng/mL TGF-β1处理细胞1、3和6 h，通过Western blot检测TGF-β通路相关蛋白磷酸化水平变化研究通路活化情况。与对照组相比，TGF-β1刺激细胞后，Smad2蛋白磷酸化增强（P＜0.05），Smad2通路被激活；同时旁路蛋白AKT和ERK磷酸化增强，差异有统计学意义（P＜0.05，图5）。结果说明，TGF-β1刺激A549细胞后，除了经典的Smad2通路，PI3K/AKT和MAPK/ERK通路也被激活。

图 3 干扰Runx2表达阻止TGF-β1诱导A549细胞发生EMT形态变化Fig. 3 Interference with Runx2 expression prevented EMT morphological changes of A549 cells induced by TGF-β1

图 4 干扰Runx2表达对于A549细胞EMT相关蛋白水平的影响Fig. 4 Effect of Runx2 siRNA on EMT-related protein expression induced by TGF-β1 in A549 cells

图 5 5 ng/mL of TGF-β1作用A549细胞1 h后激活Smad2通路、PI3K/AKT和MAPK/ERK通路Fig. 5 Smad2 pathway and the PI3K/AKT and MAPK/ERK pathways were activated in TGF-β1 induced EMT process within 1 h in A549 cells

2.4 TGF-β1主要通过PI3K/AKT通路调节Runx2表达影响A549细胞发生EMT

分别利用特异性通路阻断剂LY294002（PI3K/AKT通路抑制剂）、PD98059（MAPK/ERK通路抑制剂）阻断TGF-β旁路。结果显示，PI3K/AKT通路被阻断后，Runx2表达明显下调，差异有统计学意义（P＜0.05），肿瘤细胞未发生EMT形态变化；而MAPK/ERK通路阻断后，Runx2表达未发生明显变化（P＞0.05），而肿瘤细胞依然发生EMT形态变化（图6）。说明Runx2在TGF-β1诱导的A549细胞EMT过程中，主要是受到PI3K/AKT的调节。

图 6 阻断PI3K/AKT（A）和MAPK/ERK通路（B）对Runx2表达及A549细胞EMT形态变化的影响Fig. 6 Effects of blocking PI3K/AKT (A) and MAPK/ERK (B) pathways on the expression of Runx2 and EMT process in A549 cells

3 讨 论

TGF-β可以自分泌和旁分泌的形式作用于肿瘤细胞，诱导肿瘤细胞发生EMT。目前，绝大多数关于EMT的研究都是基于TGF-β诱导模型［7］。Smads家族蛋白在将TGF-β信号从细胞表面受体转导至细胞核的过程中起到关键性作用，且不同的Smad介导不同的TGF-β家族成员的信号转导［8-9］。TGF-β作为配体形成的受体复合物，激活Smads进入核内，共同激活或抑制其调节的靶基因的转录。Smads是很多EMT相关基因的转录激活因子，与多种活化/抑制因子组成“共调节复合体”调节靶基因的转录［10-11］，PEBP2/CBF家族蛋白即为其中重要一员。其中与肿瘤细胞EMT相关性最大的是Runx2［12］。Runx2介导肿瘤细胞对于TGF-β1/BMP等生长因子的反应性，沉默Runx2表达则会降低细胞对TGF-β的反应性［13］。虽然TGF-β家族激活的特异性R-Smad（Smad2/3、Smad1/5/8）能与许多转录因子发挥作用，但Runx家族蛋白是TGF-β超家族的特异性靶点之一，与TGF-β超家族信号通路的联系更为直接［14］。除此之外，Runx2的转录活性还受到其他细胞外信号通路的调控，研究发现，碱性成纤维细胞生长因子激活的ERK-MAPK通过磷酸化Runx2蛋白增强Runx2的转录活性，使细胞内的Runx2蛋白增多，从而进一步增强Runx2的转录活性［15］。

本实验利用TGF-β1诱导肺癌A549细胞，使用5 ng/mL TGF-β1诱导72 h之后，A549细胞发生明显的形态学改变，细胞形态变成长梭形，细胞变得离散，细胞间黏附消失。同时细胞上皮蛋白E-cadherin表达下调，间质蛋白vimentin、fibronectin表达明显上升，证明细胞发生了EMT过程，同时与TGF-β通路密切相关的蛋白Runx2表达也发生上调。所以，在已经构建了稳定的细胞EMT模型基础上，我们继续研究Runx2在肿瘤细胞EMT过程中的关键作用。实验结果显示，经Runx2-siRNA干扰沉默Runx2之后的细胞接受TGF-β1刺激之后，与对照组相比，细胞形态和细胞间质指标都未发生明显变化，说明沉默Runx2表达可以阻止细胞发生EMT，Runx2在细胞EMT过程中发挥着重要作用，与肿瘤的侵袭转移密切相关。本研究进一步探讨了Runx2在TGF-β1诱导的EMT过程中的机制，结果发现，在细胞接受TGF-β1刺激之后，TGF-β-Smad通路及旁路PI3K/AKT和MAPK/ERK通路都受到激活。利用特异性通路抑制剂抑制旁路PI3K/AKT通路之后，Runx2表达受到下调，而且同时肿瘤细胞也未发生EMT形态变化。而阻断MAPK/ERK通路后，Runx2表达并未受到影响，而且肿瘤细胞EMT过程也未受到阻断，表明在TGF-β旁路中，主要是通过PI3K/AKT通路调控Runx2表达进而影响肿瘤细胞EMT过程。但是，Runx2在TGF-β1诱导的EMT过程中的具体作用机制还有待进一步研究和探讨。

综上所述，Runx2在TGF-β1诱导的肿瘤细胞EMT过程中发挥着重要的作用，干扰Runx2的表达可以阻止细胞发生EMT，因此，Runx2有可能作为肿瘤治疗靶点用于抑制肿瘤早期转移。