黄文思，叶丽君，宋明哲，朱元昌，孙青，李观贵，曾勇*

(1.深圳中山泌尿外科医院生殖医学中心，深圳 518045；2.深圳中山生殖与遗传研究所，深圳 518045；3.深圳市围着床期生殖免疫重点实验室，深圳 518045)

目前，临床上常用常规精液分析的参数(包括精子浓度、总数、活动力与形态学等)来评估男性生育力。但是部分男性不育是由精子DNA损伤引起的[1]，常规精液分析参数异常的不育男性的精子DNA损伤通常增多，也有部分常规精液参数正常的不育男性的精子DNA损伤也较多，而常规精液分析不包括精子DNA损伤的检测[1]，因此常规精液分析的参数对临床诊断男性不育及男性生育力评估的价值存在局限性。近年来，DNA碎片指数(DFI)作为评估精子DNA损伤的重要指标被广泛研究，并且越来越多的研究指出DFI比常规精液分析参数对男性不育诊断和生育力评估有更好的价值[2-4]。有报道指出，精子DNA损伤与自然受孕、宫腔内人工授精(IUI)[5]和IVF低的妊娠率有关[6-7]，并与IVF/ICSI妊娠丢失的高风险存在相关性[6-8]。但是，也有报道指出DFI与辅助生殖技术(ART)妊娠结局无相关性[9-10]。可见DFI与ART治疗结局的相关性仍然存在争议。本文旨在分析DFI与IVF/ICSI治疗结局的关系，探讨精子DNA损伤对IVF/ICSI结局的影响。

材料与方法

一、研究对象

回顾性分析2017年1～12月因不孕不育前来深圳中山泌尿外科医院生殖中心就诊的夫妇，男方在男科实验室同期进行精液常规检查和DFI检测，这些夫妇后续根据ART治疗指征选择IVF或ICSI治疗。IVF治疗的指征为男方精液检查未见异常，因女方因素不育的夫妇。ICSI治疗的指征为男方精子浓度<2×106/ml；或者精子浓度2×106/ml～20×106/ml，活动精子百分率<40%或前向运动精子<25%；或者精子浓度≥20×106/ml，活动精子百分率<5%；或者正常形态前向运动精子总数≤1×106/ml的不育夫妇。

入选标准：夫妇双方无性传播疾病史、无遗传性疾病；来院治疗的第一周期，并为新鲜胚胎移植周期。

排除标准：男方排除精子浓度<2×106/ml、无精子症等因素(因DFI检测对于精子数量的需求)；女方排除输卵管积水、子宫内膜异位症、子宫肌瘤等因素。

共有311对夫妇符合上述标准，其中134对夫妇行常规IVF治疗，177对夫妇行ICSI治疗。

二、方法

1.精液参数分析：取卵日前3个月内，参照《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》第5版(WHO5th)的标准采集和处理精液标本。利用电子天平(深圳衡之宝)称量精液质量，计算精液体积。采用Makler计数池(Sefi-Makler，以色列)载样放于相差显微镜(尼康，日本)，通过计算机辅助精液分析操作系统(CASA系统，Microptic，西班牙)计算精子浓度、各级精子百分率和活动精子百分率，前向运动精子为主动地呈直线或沿一大圆周运动的精子，非前向运动精子为所有其他非前向运动的精子。使用Diff-Quik染色液(深圳华康生物)进行精子染色，在光学显微镜下人工分析精子形态学。精液常规参数的正常范围分别为：体积≥1.5 ml，精子浓度≥15×106/ml，前向运动精子百分率≥32%，活动精子百分率≥40%，正常形态精子百分率≥4%。

2.精子染色质结构分析法(SCSA)法测定DFI值：运用基于流式细胞术的SCSA法测定DFI值，使用精子核完整性染色试剂盒(浙江星博生物)进行检测，按照试剂盒说明书方法操作。经吖啶橙染色后上流式细胞仪(BD Accuri C6，美国)检测荧光，计算DFI(%)=绿色荧光精子数/(绿色荧光精子数+红色荧光精子数)×100%。根据DFI参考值将IVF和ICSI周期的患者分别分为DFI≤30%组和DFI>30%组[11-13]。

3.精液处理：男方禁欲2～7 d，在取卵日通过手淫法取精，精液在室温下液化后，采用密度梯度离心法处理精液，再置于37℃、5%CO2培养箱中培养备用。

4.控制性促排卵和卵母细胞收集：本中心采用标准方案、常规长方案、短方案和超长方案促排卵。当优势卵泡直径≥18 mm时，注射HCG，34～36 h后行阴道B超穿刺取卵，卵细胞置于37℃、5%CO2培养箱中培养备用。

5.治疗方式：(1)IVF治疗：卵母细胞培养3～5 h后授精，每个卵母细胞加入5～10万个精子。受精后16～18 h去除卵丘细胞，观察受精情况，出现2个原核为正常受精。观察受精后胚胎的卵裂及发育情况。(2)ICSI治疗：取卵后4～6 h进行卵胞浆内单精子注射。受精72 h后，根据本中心实际情况制定的胚胎评分系统将胚胎分级，然后选择1～2个优质胚胎移植。

6.观察指标、妊娠结局判断：MⅡ卵率=(MⅡ卵母细胞数目/获卵总数目)×100%；MⅡ卵受精率=(受精卵数目/MⅡ卵母细胞数目)×100%；卵裂率=(受精卵裂数目/受精卵数目)×100%；优胚率=(优质胚胎数目/受精卵裂数目)×100%；临床妊娠率=(临床妊娠周期数/移植周期数)×100%；流产率=(流产例数/临床妊娠例数)×100%。胚胎移植14 d后验血HCG，呈阳性为生化妊娠。移植5周后B超检查见子宫腔内有妊娠囊及原始搏动，即确定为临床妊娠。

三、统计学分析

采用SPSS 23.0软件进行统计分析。呈正态分布的计量数据以(均数±标准差)表示，两组间比较用独立样本t检验，采用皮尔逊相关性分析方法分析相关性；呈非正态分布的计量数据[表示方式为中位数(四分位距)]，则采用非参数Mann-Whitney U检验进行分析，采用斯皮尔曼相关性分析方法分析相关性。计数数据组间比较采用皮尔逊χ2检验分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、研究对象的基本情况

本研究共分析134个IVF鲜胚移植周期，其中DFI≤30%组100个周期、DFI>30%组34个周期，和177个ICSI鲜胚移植周期，其中DFI≤30%组100个周期、DFI>30%组77个周期。IVF周期与ICSI周期中，DFI≤30%组的DFI、男方年龄均显著低于DFI>30%组(P<0.05)，而组间不育年限、女方年龄、女方BMI、获卵数均无统计学差异(P>0.05)(表1)。

二、DFI与精液参数的相关性

在IVF与ICSI周期，男方DFI>30%组的前向运动精子百分率和活动精子百分率均显著低于DFI≤30%组(P<0.05)，而组间的精液体积差异无统计学意义(P>0.05)。另外，在ICSI周期，DFI>30%组的精子浓度、前向运动精子百分率均显著低于DFI≤30%组(P<0.05)；但在IVF周期，DFI>30%组与DFI≤30%组间的其他精液参数(包括精子浓度、非前向运动精子百分率与正常形态精子百分率)差异均无统计学意义(P>0.05)(表2)。

在IVF与ICSI周期，DFI与前向运动精子百分率、活动精子百分率均呈中度负相关。在ICSI周期，DFI还与精子浓度、非前向运动精子百分率、正常形态精子百分率呈极弱负相关(表3)。

表1 不同DFI组的患者基本情况及各项观察指标的比较 (-±s)

注：与DFI≤30%组比较，*P<0.05

表2 不同DFI水平的各项精液参数的比较 [中位数(四分位距)]

注：与DFI≤30%组比较，*P<0.05，#P<0.001

表3 DFI与各精液参数的相关性分析

注：|r|<0.3，极弱相关；0.3<|r|<0.5，低度相关；0.5<|r|<0.8，中度相关；|r|>0.8，高度相关。与DFI的相关性分析，*P<0.05，#P<0.001

三、DFI与IVF/ICSI治疗结局的关系

在IVF周期，DFI>30%组的受精率、卵裂率均显著低于DFI≤30%组(P<0.05)，但两组的优胚率差异无统计学意义(P>0.05)。在ICSI周期，DFI>30%组的优胚率显著低于DFI≤30% 组(P<0.05)，而两组的胚胎发育情况包括受精率、卵裂率差异均无统计学意义(P>0.05)。另外，无论行IVF治疗还是行ICSI治疗，不同DFI水平的临床妊娠率差异无统计学意义(P>0.05)；DFI>30%组的流产率高于DFI≤30%组，但差异无统计学意义(P>0.05)(表4)。

在IVF周期，DFI与受精率、卵裂率均呈极弱负相关(P<0.05)。但是，在ICSI周期，DFI与受精率、卵裂率、优胚率均没有相关性(P>0.05)(表5)。

表4 不同DFI水平的IVF和ICSI结局各项观察指标的比较(%)

注：与DFI≤30%组比较，*P<0.05；a：早期流产；b：晚期流产；a+b：早期流产和晚期流产

表5 DFI与IVF和ICSI治疗结局各指标的相关性分析

注：|r|<0.3，极弱相关；0.3<|r|<0.5，低度相关；0.5<|r|<0.8，中度相关；|r|>0.8，高度相关。与DFI的相关性分析，*P<0.05

讨论

近年越来越多研究关注精子DNA损伤，一方面是由于特发性不育男性中精子DNA断裂发生率高；另一方面是由于DNA断裂的精子被用于辅助生殖受精可能带来潜在的不良结局。

本研究显示DFI>30%组的男方年龄显著高于DFI≤30%组，但精子DFI与年龄相关性较弱。Vagnini等[14]的研究结果也表明随着年龄的增加精子DFI有所增加，但临床意义有限。Singh等[15]对此现象的解释是随着年龄的增长，清除凋亡精子的机制减退，不能有效清除DNA受损的精子，可能是DFI升高的原因之一。随着年龄的增加，男性生殖功能逐渐减退，Belloc等[16]研究发现男方年龄也是影响临床妊娠率的重要因素，临床妊娠率随男方年龄的增加而下降，从<35岁时的14.4%下降至>45岁时的9.3%(P<0.01)。本研究组发现男方年龄与IVF周期的受精率、卵裂率、临床妊娠率呈极低到低度的负相关(r分别为-0.371、-0.377和-0.227，P<0.05)，与ICSI周期的优胚率呈低度负相关(r=-0.321，P<0.05)(数据未显示)。这提示男方年龄可能影响IVF/ICSI的治疗结局，在一定程度上对DFI与IVF/ICSI的治疗结局相关性分析造成影响。

精子DNA损伤与精液质量相关[1，4，17]；而有的报道则指出精子DNA损伤与精液参数无相关性[18]。本研究发现，无论IVF周期还是ICSI周期，DFI>30%组的前向运动精子百分率均显著低于DFI≤30%组，且DFI与前向运动精子百分率呈中度负相关。另外，在ICSI周期DFI>30%组的精子浓度、非前向运动精子百分率与正常形态精子百分率均显著低于DFI≤30%组，且DFI与这些精液参数呈极弱到低度的负相关。这说明精子DNA损伤与精液质量存在相关性，尤其是前向运动精子百分率。刘作强等[19]发现IVF的受精率、优胚率与精液常规参数无相关性，但优胚率与DFI呈负相关，建议临床中应重视精子功能检查，以获得更好的治疗结局。本研究组也发现精液参数包括精子浓度、前向运动精子百分率、活动精子百分率和正常形态精子百分率等与IVF的受精率、卵裂率以及ICSI的优胚率无相关性(P>0.05)(数据未显示)，然而DFI与IVF的受精率、卵裂率均呈极弱负相关(P<0.05)。结果表明，DFI可作为评估精子功能的一项指标，也是精液常规分析参数的有效补充，对其的检查有益于临床评估男性生育力。

不少研究报道精子DNA损伤对胚胎发育和临床妊娠情况的影响，有研究指出精子DNA损伤在IVF与ICSI周期对优胚率和临床妊娠率存在负面影响[6，13，20]。国内的一篇Meta分析也显示，在IVF周期，高DFI降低IVF的受精率、优胚率和临床妊娠率，增加IVF和ICSI的流产率，但对ICSI的受精率、优胚率和临床妊娠率无影响[21]，建议高DFI患者选择ICSI治疗[21-22]。有学者则认为DFI与IVF和ICSI结局没有相关性，Sun等[12]研究了238个IVF周期和152个ICSI周期，在IVF或ICSI周期DFI>30%组与DFI≤30%组的受精率、优胚率和临床妊娠率的差异无统计学意义(P>0.05)，提出DFI不能预测行ART治疗患者的受精率、胚胎质量和临床妊娠率。存在这些争议可能原因有：一是研究对象的入选标准不同，二是DFI检测方法不同，三是卵母细胞对精子DNA损伤的修复能力不同等。

本研究比较IVF鲜胚移植的临床结局发现，DFI>30%组IVF周期的受精率与卵裂率较DFI≤30%组降低，DFI与受精率、卵裂率均呈极弱的负相关，而不同DFI组的临床妊娠率和流产率的差异无统计学意义(P>0.05)，这提示DFI可能影响早期胚胎发育，对IVF周期的临床结局无明显影响。比较ICSI鲜胚移植的临床结局发现，DFI>30%组的优胚率较DFI≤30%组降低，这提示精子DNA损伤对胚胎的前期发育有负面影响。但是，DFI的增多没有降低ICSI的临床妊娠率，虽然ICSI的流产率增加，但差异无统计学意义(P>0.05)。由此可见，DFI在一定程度上可以预测IVF和ICSI的胚胎前期发育，但对IVF和ICSI临床结局的预测价值有限，这可能与卵母细胞可以修复精子DNA损伤[23]有关。这可能提示在IVF周期中，精子DNA损伤可能导致受精率和卵裂率降低[24-26]；而ICSI治疗能“绕过”精子DNA损伤给精子和卵母细胞受精时带来的影响[27]，但无法准确地筛选到DNA完整的精子进行注射，因此DFI>30%组的优质胚胎率有可能降低；随着后续卵母细胞对精子DNA损伤的修复作用，使胚胎发育正常，不同DFI组间临床结局的差异缩小。

综上所述， DFI检测可作为常规精液分析的补充。另外，精子DNA损伤可能影响ART的早期胚胎发育，降低IVF周期的受精率与卵裂率，和ICSI周期的优胚率，提示精子DFI检测对预测ART的早期胚胎发育有一定参考价值，但对ART的临床妊娠结局的预测价值有限。