李 祥 江云兵 李同建 文 锋 方荷芳 贾明良

（九江学院，江西九江 332000）

木通［Akebia quinata（Houtt.）Decne.］为通科（Lardizabalaceae）木通属（Akebia）的一种落叶或半常绿木质藤本植物，通常有小叶5片，因而常被称为五叶木通［1］。木通具有较高的药用价值，味微苦，性平，具有舒肝和胃，活血止痛，软坚散结，抗炎、利尿、抑菌等功效［2，3］，其中的活性物质包括三萜皂苷类成分、甾醇、齐墩果酸等［4-7］。叶片姿态优美，既可观花又可赏果，且果实可以食用，是一种观赏价值非常高的垂直绿化材料及新型水果资源［8、9］。

除药用和绿化外，当前对于木通的研究利用还包括核型分析、栽培技术等方面［10-11］。同属的三叶木通已有了很多组织培养的报道［12-16］，而对于木通的组织培养研究尚未见报道，因此有必要对其组织培养进行研究，为进一步的进行优质资源的开发和品系改良奠定基础。为此，笔者利用木通的幼嫩枝条作为外植体，对其愈伤诱导、褐化抑制以及腋芽萌发诱导等过程进行了初步研究，为进一步完善木通组织培养体系，并进行品系改良和遗传转化提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料本实验所选取材料来自九江学院木通种质资源圃，以优良品系木通幼嫩茎段为外植体。取材时间为春季的3—5月份木通抽条生长的旺盛时期，尽量保证实验材料的状态一致。选择晴朗天气取材，然后将材料置于采样袋内，喷水保湿后带回实验室。

1.2 实验方法

1.2.1 获取无菌外植体 采用木通幼嫩的茎段为外植体，流水冲洗后在超净工作台中用75%酒精消毒1min，无菌水冲洗3次，再利用0.1%的氯化汞水溶液（升汞）进行灭菌处理，处理时间梯度设置为1、3、5、10、15min，随后无菌水冲洗5次以洗净升汞残留，置于无菌瓶中待用。将灭菌后的幼嫩茎段切割为0.5cm左右长度，平放接种入培养基（MS+2，4-D 2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L），每瓶5个外植体，于培养室（25±2）℃、见光条件（光周期12h/d）下培养观察，15d后记录污染率、褐化率等生长情况。

1.2.2 诱导茎段愈伤组织 将灭菌后的幼嫩茎段切割为0.5cm左右长度，接种至不含激素的MS培养基以及添加不同浓度的2，4-D（设定浓度为1.0、2.0、5.0mg/L）和6-BA（设定浓度为0.1、0.5、1.0mg/L）的MS培养基中，每瓶接种5个外植体，每个处理接种6瓶，于培养室中培养20d后，记录出愈时间（d）、愈伤组织诱导率（%）、褐化率（%）及愈伤生长情况。培养条件为：温度（25±1）℃，光照强度1500～2000lx，光照周期12h/d。

1.2.3 愈伤褐化抑制 以木通幼嫩茎段为外植体，利用1.2.1中筛选出的优化灭菌组合灭菌后接种至1.2.2中得到的合适愈伤诱导培养基上。考察固体培养、液体培养2种培养方式，不同浓度活性炭，见光、避光2种培养条件等因素对于褐化的影响，以期望得到合适的褐化抑制方法。设置固体培养、液体培养2种培养方式，固体培养添加琼脂6.0g/L，液体则不添加琼脂。培养基中添加不同浓度活性炭（AC），AC浓度梯度设定为0、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0g/L，接种好后置于见光及避光2种条件下培养。每瓶接种5个外植体，每个处理接种6瓶，于培养室中培养20d后，记录愈伤组织诱导率（%）、褐化率（%）等数据。培养条件为：见光培养时，光照强度1500～2000lx，光照时间12h/d，温度（25±1）℃；避光培养除遮蔽光照外其余同见光培养。

1.2.4 筛选腋芽无菌萌发条件 以木通幼嫩带芽茎段为外植体，以1.2.1中筛选出的灭菌组合灭菌后接种至含有不同激素配比的MS培养基中进行腋芽诱导萌发，考查不同激素配比对腋芽萌发的影响。具体激素配比为：培养基A：6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L；培养基B：NAA 0.5mg/L；培养基C：IBA 0.1mg/L+NAA 0.2mg/L；培养基D：GA32.0mg/L。每瓶接种5个外植体，每个处理接种6瓶，于培养室中培养30d后，记录愈伤组织诱导率（%）、褐化率（%）、死亡率（%）、出芽率（%）等情况。培养条件为：温度（25±1）℃，光照强度1500～2000lx，光照周期12h/d。

1.3 数据统计分析实验数据采用Excel 2007、SPSS 18.0数据统计软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同灭菌条件对无菌外植体获得的影响对幼嫩茎段灭菌处理后接种培养，污染和褐化情况如表1所示。从表1可以看出，升汞灭菌1min和3min，污染率为100%，均不能达到较好的灭菌效果。随着升汞灭菌时间的延长，污染率逐渐降低，而褐化率则由于升汞的毒害而逐渐升高，差异显著。综合考虑污染和褐化的情况，木通幼嫩茎段合适的灭菌处理组合为75%乙醇消毒1min，后升汞灭菌10min，并用无菌水冲洗干净后接种，此时虽然污染率不是最低，但是褐化情况较低，为合适的灭菌组合。

表1 灭菌条件对无菌外植体获取的影响

2.2 不同激素配比对茎段愈伤组织诱导的影响不同激素配比下茎段愈伤组织的诱导情况如表2所示。从表2可以看出，在不添加任何激素的YS1培养基中无愈伤组织产生。有生长激素的MS培养基均可诱导出愈伤组织，出愈时间无明显差别，集中在5～7d。愈伤诱导率方面，YS8、YS4中的愈伤组织诱导率分别为85%和81%，高于其他培养基，差异显著。从褐化情况考察来看，褐化率最低的为YS5为11.67%，其次为YS3、YS4、YS7、YS8、YS9，相互之间无显著差异。其中YS4和YS8愈伤组织生长情况良好多为致密型黄白色愈伤组织，其余多为松散型白色愈伤组织。综合考虑愈伤诱导率、褐化情况以及愈伤组织的状态，木通幼嫩茎段的愈伤组织诱导合适培养基为YS8培养基，即为MS+2，4-D 5.0mg/L+6-BA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L，pH5.8。

表2 不同激素配比对茎段愈伤诱导的影响

2.3 不同抑制方式对愈伤诱导时褐化的影响以幼嫩茎段为外植体，考察固体、液体培养方式；见光、避光2种培养条件；以及不同浓度活性炭对褐化的影响，结果见表3。由表3可知：固体培养条件下，不论见光还是避光培养时，随着活性炭浓度的提高，愈伤诱导率呈现下降趋势，而避光条件下愈伤的诱导率优于见光培养的。总体而言，以避光培养，活性炭浓度为0.1g/L时愈伤诱导率最高，为86.33%，差异显著。以褐化率为标准，见光培养时，活性炭（AC）浓度为0.1g/L时最低，为5%，差异显著。而避光培养时则在活性炭（AC）浓度在5.0g/L时最低，为4.67%，其次为活性炭（AC）浓度在0.1g/L时的5%，两者并无显著差异。液体培养时，不论何种光照及活性炭（AC）浓度，外植体均逐渐死亡，无愈伤组织产生，可见液体培养不适于木通茎段诱导愈伤。综合考虑，结合2.1和2.2的结果，较好的木通幼嫩茎段愈伤诱导的培养条件为：接种至MS+2，4-D 5.0mg/L+6-BA 0.1mg/L+AC 0.1g/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L的培养基中进行避光培养。

表3 不同培养条件对愈伤诱导及褐化的影响

2.4 不同激素配比对腋芽萌发和茎段生长的影响以木通幼嫩带芽茎段为外植体，灭菌后接种至含有不同激素配比的培养基中诱导愈伤组织及芽，考查不同激素配比对腋芽萌发和茎段生长的影响，结果如表4所示。从表4可以看出，4种培养基均有腋芽萌发，但萌发率都较低，其中较高的是C培养基，为19.67%。愈伤组织诱导方面，C培养基条件下最低为5%，但C和D培养基的死亡率较高。综合考虑，4种培养基比较来看，木通腋芽无菌萌发可利用C培养基，即MS+IBA 0.1mg/L+NAA 0，2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L，进行诱导。

表4 不同激素条件下腋芽萌发及生长状况

3 结论与讨论

本研究考察了灭菌条件对后续培养的影响，得到幼嫩茎段合适的灭菌处理组合为75%乙醇消毒1min，升汞灭菌10min，无菌水冲洗干净。对不同激素条件下愈伤诱导的研究表明，茎段愈伤诱导的培养基为MS+2，4-D 5.0mg/L+6-BA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L。可见，合适的2，4-D浓度有利于愈伤的诱导，这与沈国林的研究结果一致［12］。

一般而言，避光培养以及活性炭的添加可在一定程度降低褐化的发生几率［17］，这一结论在本实验中也得到了验证，木通愈伤诱导时合适的活性炭添加浓度为0.1g/L。更高浓度的活性炭添加后则会抑制愈伤组织的产生，分析可能是由于高浓度活性炭的无差别吸附导致的负面影响［18］。褐化抑制的常用方式还有液体培养方式，但本实验接种至液体培养基中的所有外植体均死亡，这与张小红等［19］、唐利球等［20］的研究结果又不相同，分析原因可能是不同种类植物基因型差异所致的。

本研究虽通过腋芽诱导萌发得到了芽，但总体而言，腋芽萌发诱导率较低，分析原因可能是由于茎段较幼嫩，腋芽发育不足以及培养条件不合适导致的［21-23］。后续可进一步进行培养条件的优化，如选择合适生长阶段的腋芽以及合适的激素配比条件等。